Практическое задание
Фосфатазы катализируют гидролиз фосфорных эфиров. В частности, их субстратом является пара-нитрофенилфосфат (пНФФ):
Образующийся в результате реакции паранитрофенол в щелочной среде имеет желтую окраску. По интенсивности окраски раствора определяют количество образовавшегося продукта реакции. Используя эти данные, рассчитывают скорость ферментативной реакции.
a) Используя табличные данные, постройте график зависимости скорости ферментативной реакции, катализируемой фосфатазой, от концентрации субстрата.
|
Концентрация субстрата, ммоль/дм3 |
Скорость реакции, ммоль/(дм3*мин) |
|
0,5 |
8 |
|
1,0 |
15 |
|
2,0 |
28 |
|
3,0 |
35 |
|
4,0 |
38 |
|
5,0 |
40 |
Определите КМ и Vmax.
б) На основании данных о скорости ферментативной реакции при различных значениях рН, представленных в таблице, постройте график зависимости скорости ферментативной реакции от рН.
|
рН |
Скорость реакции, ммоль/(дм3*мин) |
|
4,1 |
15 |
|
4,5 |
35 |
|
5,0 |
55 |
|
5,5 |
60 |
|
6,0 |
61 |
|
6,5 |
50 |
|
7,0 |
35 |
|
7,5 |
25 |
|
8,0 |
02 |
Определите рН-оптимум фосфатазы.
в) Постройте график зависимости скорости ферментативной реакции от температуры. Данные о скорости ферментативной реакции при различных значениях температуры представлены в таблице.
|
Температура, оС |
Скорость реакции, ммоль/(дм3*мин) |
|
10 |
5 |
|
20 |
11 |
|
37 |
25 |
|
50 |
95 |
|
60 |
91 |
|
70 |
7,0 |
|
80 |
2,6 |
Определите температурный оптимум фосфатазы
г) Конкурентным ингибитором фосфатаз является фосфат. Постройте графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фосфата. Данные представлены в таблице.
|
Концентрация субстрата ммоль/дм3 |
Скорость реакции в отсутствие ингибитора, ммоль/(дм3*мин) |
Скорость реакции в присутствии ингибитора, ммоль/(дм3*мин) |
|
0,5 |
8 |
5 |
|
1,0 |
15 |
10 |
|
2,0 |
28 |
18 |
|
3,0 |
35 |
24 |
|
4,0 |
38 |
30 |
|
5,0 |
40 |
35 |
|
6,0 |
- |
38 |
|
8,0 |
- |
40 |
Определите КМ и Vmax ферментативной реакции в присутствии и в отсутствие конкурентного ингибитора. Сделайте вывод, каким образом фосфат влияет на эти показатели.
д) Фторид является неконкурентным ингибитором фосфатаз. Постройте графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фторида. Данные представлены в таблиц
е.
|
Концентрация субстрата, ммоль/дм3 |
Скорость реакции в отсутствие ингибитора, ммоль/(дм3*мин) |
Скорость реакции в присутствии ингибитора, ммоль/(дм3*мин) |
|
0,5 |
8 |
4 |
|
1,0 |
15 |
7,5 |
|
2,0 |
28 |
14 |
|
3,0 |
35 |
17,5 |
|
4,0 |
38 |
19 |
|
5,0 |
40 |
20 |
Определите КМ и Vmax ферментативной реакции в присутствии и в отсутствие неконкурентного ингибитора. Сделайте вывод, каким образом фторид влияет на эти показатели.