Лабораторная работа №15

 

ОЧИСТКА ФПФазы МЕТОДОМ ТЕРМИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ

 

Температура денатурации различных белков может значительно различаться. При определенной температуре можно добиться денатурации значительной части балластных белков, в то время как изучаемый белок при данной температуре будет находиться в нативном состоянии. Денатурированные белки можно удалить центрифугированием. Используя этот подход, можно добиться частичной очистки белка.

Реактивы: 0,3 М Na-ацетатный буфер рН 5,8,3 мМ пНФФ в0,3 М Na-ацетатном буфере рН 5,8, 0,1 н NaOH, препарат фермента.

Оборудование: термостат, центрифуга, спектрофотометр, автоматические пипетки, пробирки, штатив.

Ход работы

 Перед тем как начать очистку ФПФазы при помощи термической обработки, необходимо изучить термостабильность фермента. Для этого препарат фермента прогревают в интервале температур  35 – 90 ^оС на протяжении 5 мин. Затем пробы охлаждают и в них определяют активность как указано в лабораторной работе №12. На основе полученных данных строят зависимость активности ФПФаза от температуры предварительной обработки. Затем препарат с известными активностью ФПФазы и концентрацией белка обрабатывают в течение 5 мин при максимальной температуре, при которой фермент стабилен (устанавливают по графику). Далее пробы охлаждают в ледяной бане, осадок удаляют центрифугированием (2000 g, 15 мин). В центрифугате определяют активность фермента и содержание белка. На основание полученных результатов рассчитывают степень очистки и выход фермента по формулам:

 

                                 Удельная активность очищенного

                                              препарата фермента

  Степень очистки =   ^{_____________________________________________};

                                  Удельная активность исходного

                                              препарата фермента

 

 

Общая активность очищенного

препарата фермента

Выход =  ^{_________________________________________________}.

Общая активность исходного

препарата фермента