Лабораторная работа №16

 

ОЧИСТКА ФПФазы МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИИ НА СЕФАДЕКСЕ G-75

 

  В основе разделения белков методом гель-хроматографии лежит отличие в их относительных молекулярных массах.

Реактивы: 0,3 М Na-ацетатный буфер рН 5,8,3 мМ пНФФ в0,3 М Na-ацетатном буфере рН 5,8, 0,1 н NaOH, препарат фермента, сефадекс G-75.

Оборудование: термостат, спектрофотометр, коллектор фракций, колонка, автоматические пипетки, пробирки, штатив.

Ход работы

 Перед использованием гранулы сефадекса G-75 заливают 200-кратным объемом воды. Суспензию выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч или кипетят в течение 3 ч, Затем суспензией сефадекса G-75 наполняют колонку высотой 50 – 100 см. Колонку уравновешивают 0,3 М Na-ацетатным буфером рН 5,8, Объем вносимого в колонку препарата ФПфазы не должен превышать 5 % объема колонки. Скорость фракционирования   – 10 – 15 см³/мин. Объем фракций составляет 1 – 5 % от объма колонки.

  Во фракциях определяют активность ФПФазы и оптическую плотность при длине волны 230 нм. На основании полученных данных строят профиль элюции. По оси абсцисс – номер фракции, по оси ординат – активность фермента и Е₂₃₀. Фракции с наибольшей активностью объединяют. В данном препарате определяют активность ФПФазы и концентрацию белка. Рассчитывают степень очистки и выход фермента так, как в предыдущей работе.