Лабораторная работа №11

 

ЭКСТРАКЦИЯ фосфопротеинфосфатазы

(ФПФазы)

ИЗ КЛЕТОЧНЫХ ЯДЕР СЕЛЕЗЕНКИ БЫКА

 

ФПФазы катализируют дефосфорилирование белков. Фосфорилирование же белков осуществляют протеинкиназы. Специфическое и обратимое фосфорилирование аминокислотных остатков в молекулах белков играет важную роль в регуляции метаболизма.

Существует очень большое разнообразие молекулярных форм ФПФаз, которые отличаются друг от друга субстратной специфичностью, кинетическими параметрами, субъединичным составом, локализацией и другими параметрами. В данной работе рассматривается ФПФаза клеточных ядер. Этот фермент обладает широкой субстратной специфичностью, катализирует дефосфорилирование не только фосфопротеинов, но и низкомолекулярных субстратов: АТФ, АДФ, пара-нитрофенилфосфата (пНФФ).

Способность ФПФазы дефосфорилировать пНФФ и его чувствительность к некоторым факторам, свидетельствует о том, что этот фермент является тирозиновой ФПФазой.

 

Часть 1. Выделение клеточных ядер методом дифференциального центрифугирования

Целью данного раздела работы является выделение клеточных ядер для дальнейшей экстракции из них ФПФазы.

В основе метода дифференциального центрифугирования лежит разность в скоростях седиментации частиц, имеющих разные размеры и плотность.

Реактивы: CH₃COONa*3H₂O, CH₃COOH, KCl, MgCl₂*6H₂O, CaCl₂, NaCl, HCl, сахароза, трис.

Оборудование: центрифуга, гомогенизатор, ножницы, капроновый фильтр, марля, весы, микроскоп, центрифужные стаканы.

Ход работы

Перед работой готовят следующие растворы.

1. Буфер А:0,3 МNa-ацетатный буфер рН 5,8. Этот буфер готовят из 2М Na-ацетатного буфера рН 5,8,  который получают следующим образом:

CH3COONa*3H2O –255,8 г, CH3COOH (ледяная) – 7,2 мл.

Объем доводят до1 л водой.

2. Буфер В: 10 мМтрис-HCl, рН 7,55, содержащий 0,25 Мсахарозы, 25 мМKCl, 10 мМMgCl₂:

трис –1,21 г, сахароза –85,5 г, KCl —1,86 г, MgCl2*6H2O –2,03 г, 0,1 н HCl – 80 мл.

Объем доводят до1 лводой.

 

3. Буфер С: 10 мМтрис-HCl, рН 7,55, содержащий 3 мМCaCl₂:

трис –1,21 г, сахароза –85,5 г, KCl –1,86 г, CaCl2 –0,333 г, 0,1 н HCl – 80 мл.

Объем доводят до1 лводой.

 

4. Раствор Д:0,2 М NaCl:

NaCl –11,7 г

Объем доводят до1 лводой.

  Клеточные ядра выделяют при температуре +4 ^оС.

  Выделение ядер включает следующие этапы.

1. После размораживания (2 –80 г) ткань измельчают ножницами.
2.  К измельченной ткани добавляют буфер В в соотношении 1 к 4. Затем ткань гомогенизируют в блендоре при максимальных оборотах 1 – 2 мин.
3. Гомогенат фильтруют через 2 слоя марли, затем через капроновый фильтр. Фильтрация необходима для отделения неразрушенных частиц и фрагментов фиброзной ткани.
4. Фильтрат центрифугируют при800 gв течение 7 минут. Центрифугат отбрасывают.
5. Осадок промывают буфером В. Для этого осадок ядер суспензируют в буфере и затем центрифугируют при800 gв течение 7 минут.
6.  Осадок промывают буфером С, так же как в предыдущем случае. Этот этап необходим для лизиса эритроцитов.
7. Осадок промывают раствором Д и затем буфером А. Очищенные ядра используют в дальнейшей работе.

 

Часть2. Экстракция ФПФазы из клеточных ядер

  Для экстракции ферментов используют разные методы. К таким методам относятся: механическое разрушение ткани, ультразвуковая обработка, замораживание – оттаивание, использование различных соединений, которые способствуют салюбилизации ферментов и др.

  Целью данного раздела работы является определение концентрации Na-ацетатного буфера, которая более всего подходит для экстракции ФПФазы.

Реактивы: 2М Na-ацетатный буфер рН 5,8.

Оборудование: центрифуга, гомогенизатор, центрифужные стаканы.

Ход работы

 Для экстракции ФПФазы мы будем использовать 0,4, 0,6, 0,8 и1 МNa-ацетатный буфер рН 5,8. Эти буферы готовят из 2М Na-ацетатного буфера рН 5,8.

  Для экстракции ФПФазы к осадку ядер добавляют 4- кратный объем буфера соответствующей концентрации. Осадок ядер тщательно суспензируют и оставляют на холоду на 20 мин. Далее суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость используют в качестве препарата фермента. В пробах определяют активность фермента (лабораторная работа №12) и содержание белка (лабораторная работа №7). На основание этих данных рассчитывают общую и удельную активность препаратов ФПФазы. Результаты заносят в таблицу.

Концентрация буфера А, М	Содержание белка, мг	Общее содержание белка, мг	Общая активность ФПФазы, ед.акт.	Удельная активность ФПФазы, ед.акт./мг
0,4
0,6
0,8
1,0

 

На основании полученных данных сделайте вывод, какую концентрацию буфера предпочтительнее использовать.