ЛАБОРАТОРНАЯ   работа  №25

 

Определение активности СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

 

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) (сукцинат: (акцептор) – оксидоредуктаза, КФ 1.3.99,1) катализирует реакцию дегидрирования сукцината в фумарат. Она является высокоспецифичным ферментом, окисляющим кроме сукцината только монометил-, моноэтил- и монохлорсукцинат. Естественным акцептором электронов в реакции окисления сукцината является цитохромная система, передающая их на кислород, что в конечном счете приводит к образованию  фумарата и воды.

 Молекулярная масса энзима около 200 кДа, в состав молекулы входит 1 моль флавина, негеминовое железо и кислотолабильный сульфид. В составе СДГ установлено  наличие двух субъединиц с молекулярной массой  27 и 69 кДа. СДГ локализована во внутренней мембране митохондрий  и входит в состав II комплекса цепи переноса электронов. СДГ является сложным белком, в качестве простетической группы выступает ФАД. В составе апоферментного белка присутствуют Fe-S-центры, которые играют важную роль в осуществлении  каталитического акта.

СДГ обладает высокой скоростью окисления янтарной кислоты. Конкурентными ингибиторами энзима являются аналоги субстрата – фумарат, малонат, ЩУК.

Определение активности этого фермента широко применяется в биохимических, биологических и др. исследованиях. Для определения активности  энзима используют различные методы. Нами использован метод определения активности СДГ, в котором в качестве конечного акцептора электронов используется феррицианид калия.

Принцип метода. Под действием СДГ сукцинат восстанавливает феррицианид калия (К₃[Fe(CN)₆]), раствор которого имеет желтую окраску, до бесцветного ферроцианида калия (К₄[Fe(CN)₆]). Активность фермента пропорциональна количеству восстановленного феррицианида.

Схема реакции:

сукцинат + 2[Fe(CN)₆]^3-  -^СДГ ®  фумарат +  2[Fe(CN)₆]^4-  +2Н⁺

Реактивы:

1. 0,1 Мфосфатный буфер, рН 7,8;
2. 0,1 Мянтарная кислота, рН 7,8;
3. 25 мМК₃[Fe(CN)₆];
4. 150 мМазид натрия (необходимо соблюдать все меры предосторожности, принятые при работе с ядами);
5. 25 мМЭДТА, рН 7,8;
6. 20 % раствор ТХУ.

В работе используется либо гомогенат ткани (1: 10) в 0,1 Мфосфатном буфере или среде выделения  митохондрий, либо суспензия митохондрий. Разведение подбирается в предварительном эксперименте.

Оборудование: Спектрофотометр СФ-46 (ЛОМО), автоматические пипетки объемом 10 – 100 мкл и 200 – 1000 мкл, пробирки, спектрофотометрические кюветы, весы аналитические

Ход работы

В пробирки вносят инкубационную смесь  следующего состава:

1. 0,1 МКалий–фосфатный буфер, рН 7,8     – 1 мл
2. 0,1 Мянтарная кислота, рН 7,8                 – 0.1 мл
3. 25 мМЭДТА, рН 7,8                                – 0,1 мл
4. 150 мМазид Na                                        – 0,1 мл
5. Н₂О                                                          – 0,1 мл

                                                                    – 1.4 мл

В пробы вносят по 0,5 мл  суспензии митохондрий, либо гомогената ткани. Образцы инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин для ингибирования цитохромоксидазы азидом натрия.

Реакцию начинают прибавлением к пробам 0,1 мл раствора феррицианида калия, пробы инкубируют в течение 15 мин. при температуре 30⁰С.

После инкубации реакцию останавливают добавлением к пробам  2.0 мл 20 % ТХУ. В контрольные пробы, содержащие все компоненты инкубационной смеси, ТХУ добавляется перед  внесением суспензии митохондрий либо гомогената. В контрольных пробах сукцинатдегидрогеназа с начала инкубации полностью денатурирована и специфического восстановления феррицианида сукцинатом не происходит.

После остановки реакции пробы центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин для осаждения денатурированного митохондриального белка. Прозрачную надосадочную жидкость фотометрируют на спектрофотометре при 420 нм. Оптическим контролем служит смесь 20 % ТХУ и0,1 Мфосфатного буфера в соотношении 1:1.

Для определения содержания феррицианида в пробах по результатам фотометрирования проб, содержащих от 100 до 1000 мкг феррицианида в 4 мл раствора строят калибровочную  кривую. По разности экстинкций (Ек – Ео) рассчитывают количество феррицианида, восстановленного за время инкубации.

Поскольку реакция протекает стехиометрически и 1 моль сукцината восстанавливает 2 моля  феррицианида, можно выражать активность СДГ количеством окисленного сукцината.

Активность фермента (в нмоль сукцината / мг белка за 1 мин) вычисляется по формуле:

 

где m – количество восстановленного феррицианида (в мкг);

М– молекулярная масса феррицианида калия;

б – содержание белка в пробе в мг;

t – время инкубации в мин.