Лабораторная работа №13
УСТАНОВЛЕНИЕ НАЧАЛЬНЫХ СКОРОСТЕЙ пНФФазной
РЕАКЦИИ И ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФПФазы
НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ
При определении активности ферментов необходимо измерять начальные скорости реакции, в противном случае активность фермента будет определена неправильно. Для определения начальной скорости ферментативной реакции строят график зависимости накопления продукта реакции от времени. Прямолинейная зависимость накопления продукта реакции от времени соответствует начальной скорости реакции.
Скорость ферментативной реакции прямопропорциональна концентрации фермента. При определенных концентрациях фермента возможна ассоциация субъединиц фермента. Активность ассоциированных или диссоциированных субъединиц может быть разной. В связи с этим при определении активности ферментов необходимо изучить влияние концентрации фермента на скорость ферментативной реакции. Диапозон концентраций, при котором наблюдается прямолинейная зависимость, следует использовать для определения активности препаратов фермента.
Реактивы: 0,3 М Na-ацетатный буфер рН 5,8,3 мМ пНФФ в0,3 М Na-ацетатном буфере рН 5,8, 0,1 н NaOH, препарат фермента.
Оборудование: термостат, спектрофотометр, автоматические пипетки, пробирки, штатив.
Ход работы
При установлении начальной скорости пНФФ-азной реакции, катализируемой ФПФазой, измеряют накопление продукта реакции в интервале 5 – 60 мин после начала реакции. Условия проведения ферментативной реакции указаны в лабораторной работе № 12. На основании полученных данных строят график зависимости накопления продукта реакции от времени. На графике определяют участок, соответствующий начальной скорости реакции.
Для определения влияния концентрации ФПФазы на скорость пНФФазной реакции используют несколько препаратов с различным содержанием фермента. Эти препараты готовят разбавлением исходного препарата ФПФазы. Далее в них определяют активность фермента. Условия проведения ферментативной реакции указаны в лабораторной работе № 12. На основе полученных данных строят график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.