Лабораторная работа №17

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ ФПФазы МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИИ НА СЕФАДЕКСЕ G-75

 

  В данной работе можно использовать колонку и данные, полученные в предыдущем опыте.

Реактивы: 0,3 М Na-ацетатный буфер рН 5,8, 3 мМ пНФФ в 0,3 М Na-ацетатном буфере рН 5,8, 0,1 н NaOH, препарат фермента, сефадекс G-75, бычий сывороточный альбумин (M_r = 67 000), яичный альбумин (M_r = 45 000), цитохром С (M_r = 13 000), трипсиноген  (M_r = 25 000).

Оборудование: термостат, спектрофотометр, коллектор фракций, колонка, автоматические пипетки, пробирки, штатив.

Ход работы

 Для определения относительной молекулярной массы ФПФазы необходимо откалибровать колонку. С этой целью через колонку пропускают белки-стандарты с известной относительной молекулярной массой. Устанавливают объем иллюции для каждого белка. Тестирование белков во фракциях проводят  по оптической плотности раствора  Е₂₈₀. Концентрация белка в препаратах 1 – 2 мг/мл. Для ФПФазы и белков рассчитывают коэффициент распределения по формуле:

V_э – V_н

К_р = ^___________,

V_в

где:   V_э – объем элюции белка;

V_в – объем занимаемый растворителем внутри гранул сефадекса;

V_н – объем занимаемый растворителем снаружи гранулсефадекса;

V_н равен объему элюции вещества, размер пор которого больше размера пор в гранулах сефадекса. Обычно для определения V_н измеряют V_э декстрана голубого;

V_в равен разнице объема колонки и V_н.

  Далее строят график зависимости lg M_r от К_р. По графику и К_р ФПФазы устанавливают относительную молекулярную массу фермента.