Лабораторная работа № 12
Определение активности ФПФазы
Для определения активности ФПФазы используют реакцию гидролиза паранитрофенилфосфата (пНФФ), которая происходит по следующей схеме:
Паранитрофенол (пНФ) в отличие от пНФФ в щелочной среде имеет желтый цвет с максимумом поглощения при длине волны 410 нм. На этом свойстве основан принцип количественного определения продукта реакции.
Для определения активности ФПФазы используют следующие растворы.
Реактивы: 0,3 М Na-ацетатный буфер рН 5,8,3 мМ пНФФ в0,3 М Na-ацетатном буфере рН 5,8 (2,5 мг пНФФ растворяют в 1 мл буфера), 0,1 н NaOH, препарат фермента.
Оборудование: термостат, спектрофотометр, автоматические пипетки, пробирки, штатив.
Ход работы
Все растворы перед определением активности нужно прогреть при 37 °С в течение 5 – 10 минут. Затем приготавливают пробы по следующей схеме:
|
Проба |
Буфер А, мкл |
Субстрат, мкл |
Препарат фермента, мкл |
|
Опыт |
0 |
50 |
50 |
|
Контроль |
50 |
50 |
0 |
Ферментативную реакцию проводят при 37 °С в течение 15 минут. После инкубации реакцию останавливают добавлением 3 мл0,1 МNaOH. Опытная проба должна окрашиваться в желтый цвет. Контрольная проба – бесцветная. Желтый цвет в опытной пробе обусловлен присутствием в ней пНФ. После остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора при 410 нм.
Количество полученного продукта определяют по интенсивности окраски пНФ в щелочной среде, используя молярный коэффициент экстинкции, равный 17,9 · 103 М-1 см–1 по формуле:
Е410 · V
Х = –––––––––––––,
17,9 · 103
где:
Х – количество пНФ в пробе (моль);
Е410 – оптическая плотность опытной пробы;
V – объем пробы после остановки реакции (л);
17,9 ·103 М-1.см–1 – молярный коэффициент экстинкции.
Определив количество гидролизированного субстрата, расчитывают скорость ферментативной реакции, которую выражают в нмолях гидролизованного субстрата за 1 мин. Затем в пробе определяют количество фермента в единицах активности. За единицу активности принимают количество фермента, которое гидролизует 1 нмоль субстрата за 1 минуту.