Лабораторная работа №9

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

 

Важная роль SH-групп белков в различных биохимических и физиологических процессах обусловлена их высокой реакционной способностью и многообразием химических превращений, в которые они вступают (ацилирование, окисление, алкилирование, образование меркаптидов, полумеркапталей, водородных связей и т.д.).

Для определения количества SH-групп в белках и пептидах наиболее широкое распространение получили следующие методы: амперо-метрическое титрование азотнокислым серебром, титрование п-хлор-меркурибензоатом (п-ХМБ) (метод Бойера) и определение при помощи 5,5ۥ –дитнобис

(2-нитробензоата) (ДТНБ) — реагента Эллмана.

Принцип метода: в основе метода лежит реакция тиолдисульфидного обмена в ходе которой освобождается анион 2-нитро-5-тиобензоата, обладающий поглощением при 412 нм. Коэффициент молярной экстинкции 2-нитро-5-тиобензоата зависит от pH. Обычно реакцию проводят при щелочных значениях pH (pH 8,0—9,0). При этом принимают ε₄₁₂=14000 М^{-1 см -1}. Описываемый метод высокочувствителен и строго специфичен и может использоваться для определения количества сульфгидрильных групп в низкомолекулярных тиолах, нативных и денатурированных белках.

Реактивы:

1.  Фосфатный (или трис-HCl) буфер —10 мМраствор, pH 8,0.

2.  Исследуемый белок — 30 — 70 мкМ  (по SH-группам)  раствор в10 мМфосфатном буфере, pH 8,0, содержащем1 мМЭДТА.

3.  ДТНБ—10 мМраствор в10 мМфосфатном буфере, pH 8,0.

Оборудование: пробирки, кюветы, спектрофотометр, гомогенизатор, центрифуга с охлаждением.

Ход работы

B кювету спектрофотометра вносят раствор белка и добавляют 5 — 10-кратный молярный избыток ДТНБ над сульфгидрильными группами. Полученную смесь перемешивают и через 5 — 10 мин измеряют оптическую плотность при 412 нм. Спустя 30 мин проводят повторное измерение оптической плотности, используя в качестве контроля раствор, содержащий равное количество ДТНБ, но не содержащий белка или низкомолекулярного тиола. Обычно реакция протекает очень быстро и максимальная   оптическая    плотность   достигается    через 5 — 10 мин после начала реакции. Описанное определение количества сульфгидрильных групп можно проводить в присутствии денатурирующих белки агентов (6 Mгуанидинхлорид или8 Mмочевина). B этих условиях происходит полная денатурация белка и удается определить суммарное количество сульфгидрильных групп, приходящихся на моль белка. Зная, что в ходе реакции модификация одной сульфгидрильной группы сопровождается освобождением одного аниона 2-нитро-5-тио-бензоата, можно, определив оптическую плотность при 412 нм и зная коэффициент молярной экстинкции 2-нитро-5-тиобензоата, определить концентрацию сульфгидрильных групп в анализируемой инкубационной среде.

Если сульфгидрильные группы анализируемого белка высоко реакционноспособны и легко подвергаются окислению, их определение можно проводить в присутствии восстановителей (дитиотреитола. меркаптоэтанола). B этом случае к раствору белка, содержащему восстановители, добавляют ДТНБ так, чтобы конечная концентрация реагента в 5 — 10 раз превышала суммарную концентрацию тиолов в инкубационной среде. После окончания реакции смесь подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом G-50 или биогелем P-10 и отделяют белок от смеси низкомолекулярных соединений. K раствору белка, сульфгидрильные группы которого модифицированы ДТНБ, добавляют 3 — 5-кратный молярный избыток дитиотреитола. Концентрацию освобождающегося аниона 2-нитро-5-тиобензоата определяют по поглощению при 412 нм.