Лабораторная работа №6
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ
Принцип метода: метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с ионами двухвалентной меди. Существуют две разновидности этого метода: при одной из них определяют от 2 до 10 мг белка в пробе, чувствительность другой (микрометода) — от 0,1 до 2 мг.
Реактивы:
1.Стандартный раствор белка, например сывороточного альбумина, содержащий 10 мг в 1 мл, раствор белка концентрации Х.
2.Биуретовый реактив: 0,15 гCuSО4·5H2О и 0,6 г NaKC4H4O6·4H2O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н2О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-го раствора NaOH (свободного от Na2CO3), добавляют0,1 г KI и раствор доводят водой до 100 мл. Хранят в парафинированной или полиэтиленовой посуде.
Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр.
Ход работы
K 1 мл раствора, содержащего от 2 до 10 мг белка, добавляют 4 мл биуретового реактива. Пробы перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего фотометрируют на при 540 нм. По полученным результатам строят калибровочный график зависимости оптической плотности раствора Д540 от концентрации белка.
Содержание белка в исследуемом растворе рассчитывают по калибровочному графику. Определению мешает присутствие солей аммония.
Микроопределение белка по биуретовому методу
Реактивы:
1. Стандартный раствор белка, например сывороточного альбумина, содержащий 1 мг в 1 мл, раствор белка концентрации Х.
2. Биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедикта): 17,3 гцитрата натрия и 10 гNa2CO3 растворяют при подогревании в небольшом количестве воды. B раствор добавляюг1,73 г сульфата меди, растворенного в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл.
3. NaOH — 6 %-й раствор.
Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр.
Ход работы
K 2 мл раствора, содержащего 0,1—2 мг белка, добавляют 2 мл 6 %-го раствора NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 330 нм на спектрофотометре. Предварительно строят калибровочный график по стандартному раствору белка.
Состав проб:
|
№ пробы |
Р-р белка (1 мг/мл), мл |
вода мл |
NaOH 6 % мл |
Реактив Бенедикта мл |
|
1 |
2,0 |
0 |
2,0 |
0,2 |
|
2 |
1,0 |
1,0 |
2,0 |
0,2 |
|
3 |
0,6 |
1,4 |
2,0 |
0,2 |
|
4 |
0,4 |
1,6 |
2,0 |
0,2 |
|
5 |
0,2 |
1,8 |
2,0 |
0,2 |
|
6 (контроль) |
0 |
2,0 |
2,0 |
0,2 |
|
7 |
белок конц. Х 2,0 мл |
0 |
2,0 |
0,2 |