Лабораторная работа № 2

 

Реакции осаждения белков

 

Реакции обратимого осаждения белков

Реакции осаждения белков бывают обратимыми и необратимыми. При обратимом осаждении макромолекулы белка в основном не подвергаются глубокой денатурации, а осадки могут быть снова растворены в первоначальном растворителе. Обратимое осаждение вызывается действием нейтральных солей аммония, щелочных и щелочно-земельных металлов (высаливание), спирта, ацетона, эфира и некоторых других органических растворителей.

Реактивы: раствор яичного белка с добавлением хлорида натрия (белок одного  куриного яица отделяют от желтка и растворяют в 230 см³ дистиллированной воды, к которой прибавляют 100 см³ насыщенного раствора хлорида натрия, раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3–4 слоя, и хранят в холодильнике); насыщенный раствор сульфата аммония; сульфат аммония, растертый в порошок; 10 %-й раствор гидроксида натрия; 1 %-й раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки; воронка для фильтрования; бумажные фильтры.

Ход работы

Задание 1. Осаждение белков сульфатом аммония.

1. В пробирку отмерьте 2–3 см³ раствора яичного белка, добавьте равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и смесь перемешайте.
2. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтруйте на бумажном фильтре.
3. К фильтрату добавьте порошок сульфата аммония до получения насыщенного раствора (последняя порция не растворяется).
4. Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтруйте.
5. Фильтр с осадком альбуминов промойте 5 см³ воды, собирая фильтрат в чистую пробирку.
6. Проделайте с фильтратом биуретовую реакцию. Произошло ли растворение альбуминов?

Задание 2. Осаждение белков спиртом.

Органические растворители вызывают осаждение белков вследствие разрушения гидратной оболочки макромолекул.

1. В пробирку налейте 1 см³ раствора яичного белка с добавлением хлорида натрия.
2. По каплям прилейте 4–6 см³ спирта и сильно взболтайте. Через 5–8 мин. выпадает осадок белков.

 

Реакции необратимого осаждения белков

При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация и агрегация белка. Денатурированный белок не способен к восстановлению своих первоначальных физико-химических и биологических свойств. Необратимое осаждение вызывается высокой температурой, действием концентрированных минеральных и некоторых органических кислот, ионов тяжелых металлов, алкалоидных реагентов, детергентов, красителей.

Реактивы: водный раствор яичного белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе №1; концентрированные серная, соляная и азотная кислоты; 5 %-й раствор ацетата свинца; 2,5 %-й раствор нитрата серебра; 5 %-й раствор сульфата меди.

Задание 1. Осаждение белков минеральными кислотами.

Реакция находит применение для быстрого определения белка в биологических жидкостях, например, моче.

Ход работы

Данную работу необходимо выполнять в вытяжном шкафу, соблюдая особую осторожность!

1. В три пробирки налейте по 15–20 капель концентрированных кислот: в первую – серной; во вторую – азотной и в третью – соляной.
2. Пробирки наклоните под углом 45^о и ОСТОРОЖНО (из пипетки) наслоите по стенке раствор белка. Пробирку держите отверстием от себя. На границе белка и кислоты появляется белое кольцо.
3. Пробирки осторожно встряхните. Осадки растворяются в серной и соляной кислотах, но не растворяются в азотной кислоте.

Задание 2. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Белки осаждаются солями меди, свинца, ртути, цинка, серебра и других тяжелых металлов. Свойство белков связывать ионы тяжелых металлов используется в медицине при оказании первой помощи пострадавшим от отравления солями меди, свинца, ртути.

Ход работы

1. В три пронумерованные пробирки налейте по 5-10 капель раствора белка.
2. В первую пробирку по каплям прибавьте раствор ацетата свинца. Образуется осадок. Добавьте еще несколько капель, осадок должен раствориться в избытке раствора соли.
3. Во вторую пробирку по каплям приливайте раствор нитрата серебра. Образовавшийся осадок в избытке соли не растворяется.
4. В третью пробирку прибавьте раствор сульфата меди до появления осадка. Убедитесь, что осадок растворяется в избытке соли.

Оформление результатов

Оформите результаты проведенных исследований в виде таблицы.

Осаждающий реагент	Описание осадка	Растворимость осадка в избытке реагента

 

Тепловая денатурация белка

При нагревании белки денатурируют. На процесс денатурации оказывают сильное влияние рН раствора и добавление электролитов.

Реактивы: водный раствор яичного белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе №1); 1%-й раствор уксусной кислоты; 10 %-й раствор уксусной кислоты; 10 %-й раствор гидроксида натрия; насыщенный раствор хлорида натрия.

Оборудование: пробирки, водяная баня или спиртовка.

Ход работы

1. В пять пронумерованных пробирок налейте по 10 капель раствора яичного белка.
2. Белок в первой пробирке нагрейте до кипения. Раствор мутнеет (разрушаются гидратные оболочки вокруг макромолекул), но осадок не образуется. Мицеллы, образованные макромолекулами, сохраняют одноименный заряд, что препятствует их осаждению.
3. К раствору белка во второй пробирке добавьте одну каплю 1 %-го раствора уксусной кислоты и нагрейте до кипения. Осадок белка выпадает быстро. Заряд мицелл нейтрализован и белок близок к изоэлектрической точке.
4. К раствору белка в третьей пробирке прибавьте 1-2 капли 10 %-ого раствора уксусной кислоты  и нагрейте до кипения. Осадок не образуется, так как мицеллы белка приобрели, присоединяя ионы водорода, положительный заряд, что препятствует их осаждению.
5. В четвертую пробирку добавьте 1–2 капли 10 %-го раствора гидроксида натрия и нагрейте до кипения. Осадок не выпадает. Мицеллы за счет отщепления протонов от карбоксильных групп боковых цепей белка заряжены отрицательно.
6. В пятую пробирку прибавьте 1–2 капель насыщенного раствора хлорида натрия и нагрейте до кипения. Белок выпадает в осадок.

Оформление результатов.

Оформите результаты исследования, заполнив таблицу и кратко записав механизм денатурирующего действия исследуемого фактора в виде вывода.

 

№ про-бирки	Добавляемый электролит	Наблюдаемый эффект денатурации	Вывод