Лабораторная работа №7

 

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА  МЕТОДОМ ЛОУРИ

 

Принцип метод.  Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10 — 100 мкг белка в пробе). Ha развитие окраски влияет большое количество веществ: компоненты буферных систем (трис-буфер в концентрации0,2 мМ, глицилглицин), восстановители (цистеин, дитиотреитол в концентрации 0,01 —0,4 мМ, аскорбиновая кислота), комплексоны (ЭДТА в концентрации0,5 мМ), детергенты (тритон X100 в концентрации 0,1 — 0,2 % вызывает выпадение осадка), сернокислый аммоний в концентрации 0,15 %, сахароза в концентрации 10 % и др. В связи с этим при построении калибровочного графика для определения белка по методу Лоури в растворитель для стандартного белка необходимо включать все компоненты, содержащиеся в анализируемых пробах. B некоторых случаях целесообразно предварительное осаждение белков из растворов, например трихлоруксусной кислотой, с последующим растворением их в щелочных растворах, или очистка белковых растворов от низкомолекуляриых компонентов путем диализа или гель-фильтрации на сефадексе G-25.

Интенсивность окраски комплекса, которая пропорциональна количеству белка в исследуемой пробе, измеряется спектрофотометрически.

Для исключения случайных ошибок, которые могут возникать в процессе измерения, рекомендуется не огра­ничиваться одним измерением (готовят 2 ряда пробирок)

При определении концентрации вещества в растворе следует соблюдать следующую последовательность в ра­боте:                                                                                   

а) построение калибровочной кривой для данного ве­щества;

б) измерение оптической плотности исследуемого рас­твора и определение концентрации вещества в растворе по калибровочной кривой.

Реактивы:

Реактив №1: 2 %-й раствор  Na₂CO₃ в 0,1 н. растворе NaOH.

Реактив №2: 0,5 %-й раствор CuSO4 * 5H₂O в 1%-м цитрате натрия.

Реактив №3 готовится непосредственно перед работой: 15 мл реактива I +  0,3 мл реактива №2.

Реактив №4  Реактив Фолина — Чокальтеу: 10 гNa₂Wo₄*2H₂O (перекристаллизованный) и 2,5 г Na₂MoO₄*2H₂0 помещают в круглодонную колбу на 200 — 250 мл, приливают 70 мл воды и хорошо перемешивают. K полученному раствору добавляют      5 мл 85 %-го раствора   фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной HCl (x.ч.). Колбу присоединяют к обратному холодильнику (на шлифе), ставят на сетку и кипятят в течение 10 ч. Затем в раствор добавляют 15 г Li₂SO₄, 5 мл воды и одну каплю брома. Раствор перемешивают и нагревают для удаления брома. После охлаждения доводят водой до 100 мл, фильтруют и разводят водой с таким расчетом, чтобы получился 1 н раствор кислоты (т.е. приблизительно вдвое). Кислотность определяют титрованием разведенного в 10 раз реактива 0,1 н. щелочью в присутствии фенолфталеина. Реактив может храниться в темной склянке длительное время.

Реактив №5: стандартный раствор белка, содержащий 0,25 мг  в 1 мл раствора.

Реактив №6: раствор белка концентрации Х.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр.

Ход работы

Используя стандартный раствор белка и дистиллированную воду в 4 пробирках готовят  растворы белка различной концентрации. Пятая проба не содержит белка и служит контролем на реактивы. В шестую пробирку  помещают 0,4 мл р-ра белка неизвестной концентрации-Х (см. таблицу).

№ пробы	Концентра- ция белка, мг/мл	Объем стандартного раствора белка, мл	Объем дистиллированной воды, мл	Общий объем исследуемой пробы , мл
1	0,063	0,1	0,3	0,4
2	0,120	0,2	0,2	0,4
3	0,183	0,3	0,1	0,4
4	0,250	0,4	0	0,4
5(К)	0	0	0,4	0,4
6(Х)	х	0,4(мг х)	0	0,4

 Во все пробирки добавляем  по 2 мл реактива №3, смесь тщательно перемешивают. Через 10 мин добавляют 0,2 мл реактива №4 Фолина — Чокальтеу. Реакционную смесь перемеши­вают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

Интенсивность развившейся окраски измеряют спектрофотометрически (при длине волны 750 или 500 нм) Построение калибровочной кривой производят следу­ющим образом. Измеряют оптичес­кие плотности каждого из этих растворов и строят график (калибровочную кривую), откладывая по горизонтальной оси (ось абсцисс) известные концентрации, а по вертикаль­ной оси (ось ординат) —соответствующие им значения оп­тической плотности.

Пользуясь калибровочной кривой, определяют неиз­вестную концентрацию белка в исследуемом растворе, соответствующую измеренному значению оптической плот­ности.

B случае предварительного осаждения белка к исследуемому раствору добавляют CCl₃COOH из такого расчета, чтобы конечная концентрация ее была равна 3 — 4 %. Раствор тщательно перемешивают и оставляют на 10—20 мин. Выпавший осадок белка отделяют центрифугированием и промывают 2%-ным раствором CCl₃COOH. K осадку добавляют 1 — 2 мл 1 н. раствора щелочи и осторожно подогревают до растворения осадка белка. Раствор белка количественно переносят в мерную колбу на 25 — 50 мл, доводят водой до метки, тщательно перемешивают и проводят определение белка.

 

Спектрофотометрический метод

Метод основан на способности ароматических аминокислот (трип­тофана, тирозина и в меньшей степени фенилаланина) поглощать ульт­рафиолетовый свет с максимумом при 280 нм. Измеряя величину опти­ческой плотности при этой длине волны, находят количество белка в растворе. Поскольку белки отличаются по содержанию ароматических аминокислот, их поглощение в ультрафиолетовой области спектра мо­жет сильно различаться. Условно считают, что при концентрации «ус­редненного» белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0 (при толщине слоя жидкости в1 см).

Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеи­новых кислот и нуклеотидов.

Реактивы:  растворы сывороточного альбумина, яичного альбумина  концентрация белка  1 мг/мл.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр.

Ход работы

Измеряя оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм (в качестве кюветы сравнения используют кювету с дистиллированной водой), содержание белка рассчитывают с помощью номограммы: экспериментально полученные величины оптической плотнос­ти при 260 и 280 нм находят в соответствующих столбцах номограммы и соединяют их прямой линией; точка пересечения этой прямой со шка­лой, на которой дана концентрация белка, определяет содержание бел­ка в исследуемом растворе.

Содержание белка можно найти по формуле Калькара на основе данных определения оптической плотности при 280 и 260 нм:

Содержание белка =1,45 •λ ₂₈₀—0,74 • λ ₂₆₀  (мг/мл).

Рис. 1. Номограмма для определения белка