Лабораторная работа №51
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ
ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ В ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ
Цель работы: ознакомиться с энзиматическим методом определения пировиноградной кислоты; определить уровень пировиноградной кислоты в печени и мозге животного.
B организме животных пировиноградная кислота является одним из центральных метаболитов, участвующих в ряде ферментативных реакций. K наиболее важным реакциям обмена пирувата относятся аланинаминотрансферазная, реакции кар–боксилирования, протекающие под действием пируваткарбоксилазы и НАДФ–зависимой малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназная реакция и реакция окислительного декарбоксилирования, катализируемая пируватдегидрогеназным комплексом. Другими словами, пировиноградная кислота находится на перекрестке нескольких метаболических путей. Реакцию окислительного декарбокснлирования пировиноградной кислоты катализирует пируватдегидрогеназа (пируват–липоатоксидоредуктаза, КФ· 1.2.4.1), которая относится к числу наиболее сложных по своей структуре мультиэнзимных комплексов. Молекулярная масса комплекса, выделенного пз различных источников (E. coli, сердца свиньи и др.), составляет величину порядка (4 –9 ) · 106. B состав комплекса входят три вида ферментов, катализирующих последовательные этапы процесса окислительного декарбоксилирования пирувата: пируватдегидрогеназа, дегидролипоилтрансацетилаза и дигидролипоилдегидрогеназа. Строгая упорядоченность структуры пируватдегидрогеназного комплекса обеспечивает максимальную эффективность биохимических реакций и создает предпосылки для функционирования механизмов регуляции. Комплекс локализован исключительно в митохондриях и может быть использован как маркер этих субклеточных структур.
Скорость окисления пировиноградной кислоты контролируется одновременно несколькими регуляторными факторами – концентрацией ионов магния и кальция, неорганического фосфата, отношением окисленных и восстановленных форм пиридиновых нуклеотидов и т.д. В физиологических условиях наиболее важна регуляция активности пируватдегидрогеназного компонента комплекса, который катализирует первый, наиболее медленный этап превращения пирувата. Изменение активности фермента происходит за счет циклов фосфорилирования–дефосфорилирования. Химическая модификация осуществляется специфической киназой, фосфорилирующей ферментативный белок, и фосфатазой. Эти «регуляторные» ферменты вместе с функциональными компонентами составляют пируватдегидрогеназный комплекс.
Пируватдегидрогеназа одна из многих ферментативных систем, участвующих в метаболизме пировиноградной кислоты. Роль ее в различных тканях животных неодинакова. Например, в головном мозгу окислительное декарбоксилирование пирувата является основным путем ввода окисляемых метаболитов (ацетил–КоА) в ЦТК и заметно преобладает над другими путями метаболизма субстрата в митохондриях. Это доминирование сохраняется при различных функциональных состояниях, вплоть до экстремальных воздействий. Напротив, в митохондриях печени, сердца, почек активность пируватдегидрогеназы одного порядка с активностью аланинаминотрансферазы, пируваткарбоксилазы, НАДФ–малатдегидрогеназы, а при некоторых воздействиях значительно уступает им.
Существует несколько методов количественного определения пировиноградной кислоты в тканях и биологических жидкостях, как энзиматических, так и колориметрических. B основу данного определения положен метод Цока и Лампрехта (1970).
Принцип метода. В присутствии лактатдегидрогеназы пируват восстанавливается до лактата по реакции
пируват+НАДН+Н+↔лактат+НАД+.
Количество использованного в реакции пирувата эквивалентно количеству НАДН, убыль которого регистрируют спектрофотометрически при длине волны 340 нм.
Реактивы:
1) 0,6 н. раствор хлорной кислоты (готовят перед использованием);
2) 5 Mраствор K2CO3;
3)0,5 Mтри–этаноламиновый буфер с5 мМЭДТА, рН 7,6 (готовят накануне эксперимента, перед использованием контролируют значение рН);
4)6 мМраствор НАДН (готовят непосредственно перед проведением ферментативной реакции);
5) препарат лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27) (продажный препарат, хранящийся в холодильнике, разводят бидистиллированной водой так, чтобы полученный раствор содержал около 0,5 мг ферментативного белка в 1 мл) и или экстракт мышц 1:25.
Оборудование: пробирки, кюветы, спектрофотометр, гомогенизатор, центрифуга с охлаждением.
Ход работы
Навеску замороженной в жидком азоте (жидком воздухе) ткани мозга, печени, сердца (около 200 мг) гомогенизируют при 4 ºС с 1,8 мл 0,6 н. HClO4 (9 мл кислоты на 1 г ткани, общее соотношение 9:1). Полученный гомогенат переливают в центрифужные пробирки и оставляют во льду на 15 мин для более полной экстракции пирувата. Осажденные белки ткани отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 3000 g. Безбелковую надосадочную жидкость переносят в центрифужную пробирку и удаляют избыток хлорной кислоты, добавляя 0,2 мл 5 M раствора К2СО3. Пробу перемешивают и оставляют на 10 мин во льду для более полного осаждения перхлората калия, после чего осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием в течение 10 мин при 3000g. Нейтрализованный таким образом безбелковый экстракт нагревают до комнатной температуры и используют для проведения ферментативной реакции.
B кювету спектрофотометра (1 см) наливают 1,2 мл три–этаноламинового буфера и 0,8 мл тканевого экстракта. Пробу перемешивают и устанавливают «нуль» спектрофотометра. Затем в кювету вносят 0,05 мл раствора НАДН, снова перемешивают и измеряют исходное значение оптической плотности (Е\). После этого к пробе добавляют 0,05 мл препарата лактатдегидрогеназы (или экстракта мышц), перемешивают и через 5 – 10 мин после прекращения ферментативной реакции, о котором судят по установившейся величине оптической плотности, измеряют величину E2.
Чтобы учесть изменение оптической плотности пробы, связанное с добавлением ферментативного белка, к одной из проб после окончания лактатдегидрогеназной реакции добавляют еще 0,05 мл препарата фермента, перемешивают и сразу измеряют оптическую плотность (E3).
Расчет
Содержание пировиноградной кислоты (в мкмолях на1 гткани) рассчитывают по формуле:
X=ΔE•V•K/6,22 (мкмоль/г ткани),
где ΔE – изменение оптической плотности пробы в ходе ферментативной реакции восстановления пирувата;
ΔE=(E1–E2) – (E3–Е2);
V – конечный объем пробы и кювете (2,1 мл);
6,22 – коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиннуклеотидов при длине волны 340 нм и кювете шириной1 см;
K – коэффициент разведения по отношению к1 г ткани, в данном случае он составляет 12,44. Расчет коэффициента разведения проводят следующим образом.
При осаждении тканевых белков к 1 гткани добавлено 9 мл хлорной кислоты. Учитывая, что среднее содержание воды в тканях составляет 75 %, 1 гткани соответствует 9,75 мл кислого экстракта. Для нейтрализации кислого экстракта в пробу ввели 0,2 мл K2CO3, т.е. объем нейтрализованного экстракта, соответствующий1 г ткани, составляет 9,95 мл. Ha определение взяли 0,8 мл нейтрализованного экстракта, что соответствует 80,4 мг ткани. Следовательно, коэффициент разведения по отношению к1 г ткани составляет 1:0,0804=12,44.
Описанный энзиматический метод количественного определения пирувата хорошо воспроизводится и позволяет обнаруживать до 0,005 мкмоля пнрупата в пробе.
Оформление работы
Составить блок–схему эксперимента. Привести расчеты по приготовлению реактивов. Определить количество пировиноградной кислоты в предложенных пробах, привести расчеты.