Лабораторная работа №50
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ
МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ В ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ
Цель работы: ознакомиться с энзиматическим методом определения молочной кислоты; определить уровень молочной кислоты в печени и мозге животного.
Анаэробный распад углеводов (гликолиз) в тканях животных завершается образованием молочной кислоты, по количеству которой судят об интенсивности гликолитических процессов.
B тканях животных молочная кислота играет особую роль в связи с тем, что этот субстрат представляет собой своеобразный метаболический тупик: действительно, основным путем обмена лактата является легко обратимая лактатдегидрогеназная реакция. Скорость других реакций образования или использования молочной кислоты несравненно ниже, чем скорость взаимопревращеиия лактата и пирувата. Таким образом, лактат можно рассматривать как определенный тканевый резерв активно метаболирующего пирувата. Обратимость лактатдегидрогеназпой реакции и высокая активность фермента позволяют паре субстратов лактат–пируват играть важную роль в контроле над отношением окисленных и восстановленных форм НАД+/НАДН. Рядом авторов предложены способы расчета отношения НАД+/НАДН в цитоплазматичееком компартменте клетки с использованием результатов по содержанию лактата и пирувата в ткани.
Для определения количества молочной кислоты в тканях животных и биологических жидкостях существует несколько методов. B лабораторной практике широко применяется колориметрический метод Баркера и Саммерсона, однако более простыми, чувствительными и быстрыми являются энзиматические методы, например метод Хохорста [1970].
Принцип метода. В присутствии лактатдегидрогеназы молочная кислота переходит и пировиноградную, причем связывание образующегося и ходе реакции пирувата гидразин глициноным буфером способствует полному окислению лактата:
L–лактат+НАД++гидрозин®гидразон
–пируват+НАДН+Н++Н2О.
Образование восстановленной формы НАД, эквимолярное количеству окисленного лактата, регистрируют спектрофотометрически при длине волны 340 нм.
Реактивы:
1) 0,6 н раствор HClO4 (готовят перед употреблением);
2) 5 Mраствор K2CO3;
3) гидразин–глициновый буфер (0,4 Mгидразин,1 Mглицин, pH 9,5; готовят на 0,2 %–м растворе натриевой соли ЭДТА: растворяют навески глицина и гидразина в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят pH смеси 2 н. раствором NaOH до 9,5 и доливают дистиллированной водой до 100 мл);
4) 5·10–2 M раствор НАД (реактив готовят непосредственно перед употреблением);
5) лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27) (хранящийся в холодильнике продажный препарат фермента перед употреблением разводят бидистиллированной водой так, чтобы содержание белка составляло около 5,0 мг/мл или экстракт мышц 1:25).
Оборудование: пробирки, кюветы, спектрофотометр, гомогенизатор, центрифуга с охлаждением.
Ход работы
Навеску замороженной в жидком азоте (жидком воздухе) ткани мозга, печени, сердца (около 200 мг) гомогенизируют при 4 ºС с 0,8 мл 0,6 н. HClO4 (4 мл кислоты на 1 г ткани, общее соотношение 4:1) и переносят в центрифужную пробирку, находящуюся во льду. Осадок белка отделяют центрифугированием в течение 15 мин ирн 3000 g. Для удаления избытка хлорной кислоты к надосадочной жидкости, не содержащей белка, добавляют 0,1 мл 5 M K2CO3 (из расчета 0,05 мл на 1 мл пробы), перемешивают и помещают на лед до полного прекращения ныделения CO2. Осадок перхлората калия отделяют центрифугированием в течение 5 мин при 3000 g. Для проведения энзиматической реакции используют 0,2 мл нейтрализованного тканевого экстракта, предварительно нагретого до комнатной температуры.
В кювету спектрофотометра (1 см) наливают 2,2 мл инкубационной среды, состоящей из 2,0 мл гидразин–глицинового буфера и 0,2 мл раствора НАД; добаидиют 0,2 мл нейтрализованного тканевого экстракта и измеряют исходную величину оптической плотности (Е1) при длине волны 340 нм. Щель прибора при этом устанавливают по гидразин–глициновому буферу. K пробе добавляют 0,05 мл раствора лактатдегидрогеназы, (или экстракта мышцы) перемешивают и после окончания ферментативной реакции измеряют конечное значение оптической плотности (Е2). Об окончании реакции судят по прекращению нарастания оптической плотности пробы. Обычно время протекания реакции составляет 5 минут и зависит от активности использованного препарата лактатдегидрогеназы.
Для внесения поправки на изменение оптической плотности, связанное с добавлением ферментативного препарата, в контрольную пробу вместо 0,2 мл тканевого экстракта вносят 0,2 мл воды и проводят аналогичные измерения. Получают Ек.
Содержание лактата (в мкмолях на 1 гткани) вычисляют no формуле:
X=ΔEVK/6,22 (мкмоль/г ткани),
где ΔE— изменение оптической плотности пробы за время реакции: ΔE=(E2—E1)—EK; V — конечный объем пробы (2,45 мл ); 6,22 — коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиновых нуклеотидов при длине волны 340 нм; K — фактор разведения пробы по отношению к 1 г ткани, в данном случае равный 22,5.
Описанный метод высоко специфичен, прост, дает хорошо воспроизводимые результаты. Условия энзиматического определения содержания молочной кислоты сходны с таковыми для яблочной кислоты, поэтому при наличии в распоряжении исследователя препарата малатдегидрогеназы можно одновременно определить содержание обоих субстратов в одной пробе.
Оформление работы
Составить блок–схему эксперимента. Привести расчеты по приготовлению реактивов. Определить количество молочной кислоты в предложенных пробах, привести расчеты.