Лабораторная работа №49

 

ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСТРАКТА МЫШЦ

 

Цель работы: ознакомиться с методом получения экстракта мышц с лактатдегидрогеназной активностью.

Ход работы

Мышцы задних конечностей только что декапитированной крысы используют для получения экстракта, не содержащего митохондрий. Экстракт можно долго хранить в замороженном виде: его разливают по 1 мл в про­бирки и замораживают. Для определения молочной кислоты исполь­зуют экстракт в разведении 1:25 (разводят0,1 Mраствором калий–фосфатного буфера, pH 7,4).

Среда выделения: калий–фосфатный буфер – 0,05 M раствор, pH 7,6. Всю посуду перед работой необходимо охладить на льду. Мышцы спины и задних конечностей декапитированной крысы по­мещают в стакан с охлажденной средой выделения. Через 10 мин их вынимают по одной на чашку Петри, обсушивают фильтровальной бу­магой, очищают от жира и соединительной ткани и тщательно из­мельчают ножницами в кашицу. Навеску этой массы (3 – 5 г) берут на технохимических весах в фарфоровой чашке, предварительно взвешен­ной и стоящей во льду, и делят ее на 2 – 3 части для порционного го­могенизирования. Порцию кашицы переносят в охлажденный стеклян­ный стакан гомогенизатора Поттера с тефлоновым пестиком, добав­ляют 5 объемов среды выделения (на 1 г ткани 5 мл), перемешивают стеклянной палочкой и гомогенизируют 1–2 мин. Гомогенаг сливают в стакан. Процедуру повторяют со следующими порциями; гомогенаты объединяют. В итоге должен получится 20 %–й гомогенат: 1 мл гомогената должен содержать 200 мг ткани (разведение 1:5). Затем гомогенат мышц центрифугируют 10 мин при 12000 g–15000 g и температуре 4 ⁰C. Надосадочную жидкость, представляющую собой экстракт мышц, свободный от митохондрий, ядер и обломков клеток, фильтруют через четыре слоя влажной марли. Полученный экстракт мышц разливают по пробиркам и замораживают.