Лабораторная работа № 38
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ФРУКТОЗЫ
Цель работы: ознакомиться с фотометрическим методом определения фруктозы в биоматериале.
Принцип метода. Определение фруктозы основано на реакции Селиванова: при нагревании фруктозы или других кетоз с соляной кислотой образуется оксиметилфурфурол. Оксиметилфурфурол с резорцином образуют соединение (продукт конденсации), окрашенное в вишнево–красный цвет. Скорость образования оксиметилфурфурола в реакции фруктозы с соляной кислотой при нагревании во много раз больше, чем для альдогексоз, что обуславливает специфичность реакции Селиванова для фруктозы.
Величину экстинкции раствора, содержащего продукт конденсации образованного из фруктозы оксиметилфурфурола с резорцином, определяют фотометрически. Для количественного определения содержания фруктозы готовят стандартный раствор фруктозы (контроль),
Реактивы: исследуемый раствор фруктозы (10 — 100 мг/мл), стандартный раствор фруктозы (25 мг/мл), 0,1 %-й раствор резорцина в 96 %-м этиловом спирте, 30 %-й раствор соляной кислоты.
Оборудование: стеклянные палочки, пробирки с пришлифованным воздушным обратным холодильником, пипетки, штатив для пробирок, водяная баня, часы, термометр лабораторный, спектрофотометр.
Ход работы
B одну пробирку с пришлифованным обратным холодильником вносят 2 мл исследуемого раствора фруктозы (проба), в другую – 2 мл стандартного раствора фруктозы (контроль). Затем в обе пробирки добавляют по 2 мл раствора резорцина и по 6 мл раствора соляной кислоты. Содержание пробирок перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 8 мин при t 80 ºC. После нагревания растворы охлаждают и колориметрируют при 490 нм. Экстинкцию измеряют, используя реактивы, заменяя 2 мл раствора фруктозы 2 мл дистиллированной воды.
Массовую концентрацию фруктозы в исследуемой пробе (мкг/мл) вычисляют по формуле:
C = QE1/E2,
где E1 и E2 — экстинкция исследуемого и стандартного растворов соответственно;
Q — коэффициент, который представляет собой отношение массовой концентрации в стандартной пробе к объему пробы.
Этим методом можно определить также массовую концентрацию фосфорных эфиров фруктозы — фруктозо–1,6–дифосфата и фруктозо–6–фосфата. Ход работы такой же, как для фруктозы, но для расчета концентрации фруктозо–1,6–дифосфата найденное значение для фруктозы нужно умножить на 3,6, а для фруктозо–6–фосфата — на 2,39. Эти поправки вводятся с учетом того, что в фруктозо–1,6–дифосфате и в фруктозо–6–фосфате фруктоза составляет 53 % и 60,5% соответственно, а интенсивность ее цветовой реакции—52,3 % и 69,2 %.
Оформление работы
Привести расчеты по приготовлению реактивов. Провести количественное определение фруктозы, привести соответствующие расчеты.