Лабораторная работа №31
Количественное определение ДНК
Метод основан на свойстве дезоксирибозы, входящей в состав ДНК, образовывать синее окрашивание прямо пропорциональное концентрации ДНК.
Реактивы: дифениламиновый реактив (1 г дифениламина в 100 мл ледяной уксусной кислоты, + 2,75 мл H2SO4 конц.), дистиллированная вода, водный раствор ДНК.
Оборудование: термостат, спектрофотометр, автоматические пипетки, пробирки, штатив.
Ход работы
Вначале необходимо построить калибровочный график. Для этого в 3 пробирки наливают по 1мл раствора ДНК с различной концентрацией (50, 100, 200 мкг/мл) и по 2 мл дифениламинового реактива. Помещают пробирки на 10 – 15 минут в кипящую водяную баню для развития окраски, затем определяют оптическую плотность каждого из растворов при длине волны 595 нм. Калибровочный график строят, откладывая по оси абсцисс концентрацию использованных растворов ДНК, по оси ординат – соответствующие им значения оптической плотности.
Затем берут две пробирки: в контрольную пробирку наливают 1 мл воды, в опытную пробирку – 1 мл водного раствора ДНК (неизвестной концентрации). В каждую пробирку добавляют по 2 мл дифениламинового реактива. Обе пробирки помещают на 10 – 15 минут в кипящую водяную баню. Затем пробы охлаждают и измеряют насыщенность окраски против контроля при λ = 595 нм. Зная оптическую плотность пробы, по калибровочному графику находят количество ДНК в ней.
Состав проб
|
Про– бирки |
ДНК (мл) |
Дифенил– аминовый реактив (мл) |
H2O (мл) |
|||
|
50 (мкг/мл) |
100 (мкг/мл) |
200 (мкг/мл) |
Х (мкг/мл) |
|||
|
1 |
1 |
– |
– |
– |
2 |
– |
|
2 |
– |
1 |
– |
– |
2 |
– |
|
3 |
– |
– |
1 |
– |
2 |
– |
|
Х |
– |
– |
– |
1 |
2 |
– |
|
К |
– |
– |
– |
– |
2 |
1 |
|
10 – 15 мин кипящ. водян. баня |
||||||
|
охладить, измерить оптич. плотность при λ=595 нм |
||||||