Лабораторная работа № 29

 

ВЫДЕЛЕНИЕ   НУКЛЕОПРОТЕИДОВ ИЗ ПЕЧЕНИ

 

Реактивы: 5% –й  раствор хлорида натрия,  дифениламиновый реактив (1г дифениламина в 100 мл ледяной уксусной кислоты,

+ 2,75мл H₂SO₄ конц.), печень, дистиллированная вода.
Оборудование: гомогенизатор, центрифуга, центрифужные весы, центрифужные пробирки, стакан химический на 100 мл, пипетка на 10 мл, цилиндры на 25 и 50 мл, стеклянные палочки, штатив с пробирками, водяная баня

Ход работы

Навеску ткани печени 500 – 100 мг гомогенизируют в 5—10 мл 5%– го раствора хлорида натрия. Полученный гомогенат переносят в центрифужные пробирки, уравновешивают их на цент­рифужных весах и центрифугируют 10 – 15 минут при 1500 – 3000 об/мин

Надосадочную жидкость делят на 2 части. В одной из пробирок проводят качественную реакцию на ДНК (см. ниже). Вторую пробирку помещают в кипящую  водяную баню, предварительно добавив 3 мл 2 % – го раствора серной кислоты для проведения гидролиза  (гидролиз проводят в течении часа). Гидролизат охлаждают, центрифугируют. В надосадочной жидкости содержатся составные компоненты  нуклеопротеидов. Надосадочную жидкость разделяют на 3 части и проводят следующие качественные реакции: 1) на пуриновые основания, 2) на углеводную группировку, 3) на фосфорную кислоту.

Реакция на ДНК К 10 каплям раствора при­ливают 10–15 капель дифениламинового реактива, пере­мешивают и ставят в кипящую водяную баню на 10 – 15 минут. При нагревании дезоксирибонуклеопротеиды гидролизуются, а освободившаяся дезоксирибоза реагирует с дифениламином. Раствор дифениламина в смеси с уксусной и серной кислотами дает при нагре­вании с дезоксирибозой серо–синее окрашивание.

1. Проба на пуриновые основания. К 10 каплям гидролизата добавляют 1 каплю концентрированного раствора аммиака для нейтрализации и 5 капель 1% – го раствора AgNO₃. При стоянии выпадает рыхлый осадок бурого цвета, обусловленный образованием соедине­ний серебра с пуриновыми основаниями.

2. Качественные реакции на углеводы (рибозу и дезоксирибозу). Эти реакции основаны на способности рибозы и дезоксирибозы восстанавливать ионы металлов (медь, висмут, железо) в щелоч­ной среде.

К 5 каплям гидролизата добавляют 5 капель 30% –  го раствора гидроксида натрия  и несколько капель 7 % –го  раствора сульфата меди до появления неисчезающей мути гидро­окиси меди (II) Сu(ОН)₂. При нагревании до кипения выпа­дает желтый осадок гидрата меди (I) СuОН или красный осадок оксида меди (I) Сu₂О.

3  Молибденовая проба на фосфорную кислоту.  К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель молибденово­го реактива, представляющего собой раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте, и кипятят. При охлаждении пробирки под струей холодной водопровод­ной воды выпадает кристаллический осадок лимонно–желтого цвета, обусловленный образованием фосфорно–молибденовокислого аммония.