Работа 6. Разделение пигментов методом бумажной хроматографии
Принципы хроматографии разработаны русским физиологом М.С.Цветом в начале нашего века. Со времени начала использования хроматографии как аналитического метода исследования появилось множество ее модификаций, что значительно расширило область применения метода.
Метод бумажной хроматографии основан на распределении пигментов между целлюлозой хроматографической бумаги и подвижной фазой – растворителями. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движутся растворители, молекулы пигментов, нанесенные на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с коэффициентом распределения. Чем выше растворимость пигмента в подвижной фазе, тем дальше он продвигается по бумаге вместе с растворителем, и наоборот. Расстояние, пройденное нанесенным на бумагу пигментом в направлении движения растворителя, характеризуется величиной Rf, которая представляет собой отношение расстояния, пройденного растворенным пигментом, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя. В стандартных условиях эта величина для данного пигмента постоянна и соответствует его коэффициенту распределения. Хроматографирование на бумаге выполняют восходящим и нисходящим способами. В зависимости от цели исследования применяют одномерные и двухмерные хроматограммы.
Хроматографирование выполняют в герметично закрытых сосудах, где поддерживают насыщенную парами растворителей атмосферу, что предотвращает их испарение с бумаги. Для эффективного разделения пигментов толщина бумаги должна быть равномерной, а сама бумага обладать достаточной плотностью.
При хроматографировании получают четыре полосы пигментов, хорошо отделенных друг от друга, в такой последовательности (от стартовой линии): хлорофилл b, хлорофилл а, ксантофиллы и каротины.
Материалы и оборудование. Спиртовая или ацетоновая вытяжка пигментов, раствор для бумажной хроматографии (ацетон – 0,4 см3, этанол – 0,6 см3, петролейный эфир – 20 см3), этиловый спирт, ацетон, стеклянный стакан на 50 см3, сахарная пробирка, хроматографическая бумага (1,5
14 см), резиновая пробка с крючком, ножницы, вентилятор.
Ход работы. Возьмите лист хроматографической бумаги размером 141,5 см и на одном его конце, отступив от края 1,5 см, проведите простым карандашом при помощи линейки тонкую еле заметную линию. В химический стакан на 50 см3 налейте полученную вытяжку в количестве 3 см3 и погрузите в нее хроматографическую бумагу той стороной, ближе к которой нанесена линия. Дождитесь, пока вытяжка не достигнет линии, и достаньте ее, подсушите с помощью настольной лампы и вновь внесите в раствор. Продолжайте эти действия еще 7 раз. Затем внесите хроматографическую бумагу в чистый растворитель (этиловый спирт или ацетон) и дождитесь, пока он не достигнет нанесенной вами карандашом линии. Подсушите бумагу и вновь внесите в растворитель. Повторяйте до тех пор, пока вся бумага, находящаяся ниже линии не станет белой.
После этих действий на расстоянии 0,4 см от противоположного края хроматографической бумаги сделайте отверстие и закрепите лист на крышке сосуда для хроматографии. Подготовленную таким образом бумагу аккуратно, стараясь не касаться стенок сосуда, опустите в хроматографическую камеру со смесью растворителей. Лист хроматографической бумаги установите в камере так, чтобы его нижний конец был опущен в смесь растворителей на 0,5 см, а края не касались стенок (рис. 5).
Через 45 мин будет наблюдаться полное разделение пигментов. Достаньте хроматограмму из камеры и просушите при помощи вентилятора или фена. Полученную хроматограмму вклейте в тетрадь и обозначьте разделение пигментов на ней. Объясните, чем обусловлено такое распределение пигментов.
