Работа 4. Определение жизнеспособности клеток методом прижизненной окраски нейтральным красным
Цитоплазма обладает сложной структурой, с которой связаны ее свойства и функции. Важнейшее из этих свойств – избирательная проницаемость. Живая цитоплазма не удерживает в себе витальных красителей, которые свободно через нее проходят в вакуоль и окрашивают клеточный сок. В зависимости от концентрации водородных ионов в последнем вакуоль может приобретать ту или иную окраску, что используют для определения рН клеточного сока. Для этого сравнивают цвет вакуоли со шкалой буферных смесей, к которым прибавлена та же индикаторная краска.
Эти красители используются также и для определения жизнеспособности клеток, так как после гибели или повреждения клетки они задерживаются в самой цитоплазме в результате изменений нативной структуры белков. Цитоплазма приобретает соответствующую окраску.
В данной работе мы будем использовать наиболее безвредный и хорошо поглощаемый растительной клеткой краситель – нейтральный красный. По сравнению с другими красителями он имеет малую солевую и белковую ошибки. Его цвет изменяется от вишнево-красного (pH = 6,8) до желтого (pH = 8,0)1.
Материалы и оборудование. Луковица неокрашенного лука, 0,01 %-й раствор нейтрального красного, приготовленный на дистиллированной воде, 0,7 М раствор нитрата кальция, 10 %-й раствор аммиака, дистиллированная вода, предметное стекло, покровное стекло, фарфоровая чашка, глазные пипетки, фильтровальная бумага, набор для препарования, пинцет анатомический, микроскоп «Биолам 70-Р».
Ход работы. Поместите кусочек нижнего эпидермиса непигментированной луковицы лука в фарфоровую чашку с раствором нейтрального красного на 20 мин. Затем промокните срез фильтровальной бумагой, чтобы удалить остатки красителя, и перенесите на предметное стекло в каплю воды. Накройте покровным стеклом и рассмотрите под микроскопом сначала на малом, а затем на большом увеличении.
Затем, не снимая препарат с предметного столика микроскопа, фильтровальной бумагой удалите воду из-под покровного стекла и введите под него каплю 0,7 М раствора Ca(NO3)2. После этого наблюдайте плазмолиз клеток, накопивших краску в вакуолях.
Чтобы проследить за изменениями в клетках при их повреждении и гибели, используйте 10 %-й раствор аммиака: удалите с помощью фильтровальной бумаги нитрат кальция, проведите деплазмолиз и капните аммиак. Окраска клеток сразу станет желтой, так как в присутствии последнего реакция клеточного сока изменяется на щелочную. В погибших под действием аммиака клетках цитоплазма и ядро приобретают видимую в микроскоп структуру и окрашиваются в желто-бурый цвет.
Зарисуйте поэтапно все наблюдаемые вами процессы и сделайте вывод по результатам работы.
______________________________________