Работа 4. Определение активности полифенолоксидазы

 

Полифенолоксидазы окисляют полифенолы до хинонов. Хиноны в свою очередь могут окислять другие вещества. Например, о-дифенолоксидаза окисляет пирокатехин до ортохинона. Ортохинон способен окислять бесцветный парафенилдиамин в окрашенный продукт.

Материалы и оборудование. Клубень картофеля, фосфатный буфер (pH = 7,0 - 7,4), 0,01 %-й раствор парафенилдиамина (готовят на 0,01 н растворе щавелевой кислоты), 1 %-й раствор пирокатехина, фарфоровые ступки с пестиками (3 шт.), стеклянные пипетки на 2 см³ (5 шт.), стеклянная палочка, градуированные центрифужные пробирки на 10 см³ (6 шт.), стеклянная воронка малая (3 шт.), фильтровальная бумага, ножницы канцелярские, кухонный нож, плотный картон или разделочная доска размером 1515 см, марля, штатив для пробирок, штатив для пипеток, дозатор, секундомер.

Ход работы. В каждой из фарфоровых ступок приготовьте гомогенаты 200 мг растительной ткани (отдельно глазки, кожица и мякоть клубня картофеля) в фосфатном буфере. Буфером доведите объемы полученных гомогенатов до 5 см³. Затем профильтруйте их в пробирки, используя складчатый бумажный фильтр.

К 2 см³ каждого из фильтратов, содержащих фенолоксидазу, прилейте по 2 см³ раствора парафенилдиамина и по 2 см³ раствора пирокатехина. В течение 30 с наблюдайте за интенсивностью синего цвета в каждой из пробирок. Сравните результаты наблюдений и сделайте вывод об активности полифенолоксидазы в различных тканях одного объекта.