Лабораторная работа №54
ВЫДЕЛЕНИЕ СИНАПТОСОМ И ИХ МЕМБРАН
Цель работы: ознакомиться с основными приемами выделения субклеточных фракций.
Ход работы
Синаптосомы получают двумя методами: четырехэтапного (Hajos, 1975) и двухэтапного (Weiler, 1981) центрифугирования. Вся процедура выделения осуществляется при 4 °С. После декапитации головной мозг извлекают максимально быстро, измельчают на льду. Измельченную ткань гомогенизируют в соотношении 1:10 в среде выделения – 0,32 М раствор сахарозы на 0,01 М Трис – НСl буфере с добавлением 0,5 мМ ЭДТА (рН 7,4). Полученный гомогенат подвергают 4–этапному центрифугированию. Супернатант после первого центрифугирования (10 мин, 4500 об/мин) аккуратно отбирают, не захватывая миелинового слоя и подвергают дальнейшему центрифугированию в течение 20 мин при 14000 об/мин. Полученный плотный осадок Р2 ресуспензируют в среде выделения. Полученную суспензию используют далее в эксперименте как грубую синаптосомальную фракцию (синаптосомально–митохондриальную). В случае 4–этапного выделения второе центрифугирование проводят при 11000 об/мин в течение 20 мин. Плотный осадок Р2 ресуспензируют в 0,32 М растворе сахарозы (рН 7,4) и далее осторожно наслаивают на 0,8 М раствор сахарозы (рН 8,0), после чего центрифугируют в течение 25 минут при 11000 об/мин. В результате центрифугирования в градиенте сахарозы происходит разделение фракций – митохондрии плотно оседают на дне пробирки, а синаптосомы остаются во взвешенном состоянии в слое 0,8 М сахарозы. Этот слой аккуратно отбирают, перемешивают с равным количеством среды выделения и оставляют на 15 минут для восстановления ультраструктуры синаптосомальных частиц, после чего подвергают дальнейшему центрифугированию при 14000 об/мин в течение 30 мин. Плотный конечный осадок Р4 ресуспензируют в среде выделения и далее используют в эксперименте как синаптосомальную фракцию.
Выделение синаптических мембран: конечный плотный осадок синаптосом ресуспензируют в минимальном объеме 10 мМ натрий–калий–трис буфера без содержания фосфат–ионов (рН 7,4), замораживают до –20 °С и после размораживания двукратно отмывают этим же буфером, полученный осадок ресуспензируют в растворе Кребса – Рингера (рН 7,4) и центрифугируют при 20 000 g 30 мин при температуре 4 °С. Чистоту препаратов контролируют по показателю удельной активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ), являющейся маркерной для фракции синаптосомальных мембран.