Лабораторная работа №53
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСМОТИЧЕСКОЙ ПРОЧНОСТИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЛОЩАДИ ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК
Все многообразие механизмов регулирования активности биологических систем можно разделить на две группы: специфические, связанные с действием специфических регуляторов – эффекторов, и неспецифические, связанные с варьированием физико–химических свойств окружения. Состояние биологических молекул, субклеточных органелл, клеток во многом определяется условиями среды, в которую помещены биосистемы. Варьирование таких параметров среды, как температура (мера средней скорости хаотического движения молекул), рН среды (отрицательный десятичный логарифм концентрации ионов водорода в среде), ионная сила (І = ½ Σ Ni Zi, где Ni – объемная концентрация i–го иона, Zi– зарядовое число иона), осмолярность (сумма концентраций всех непроникающих через мембрану частиц, единица измерения осмолярности – осмол). Осмолярность определяет разность осмотического давления по обе стороны мембраны, соответственно, потоки вещества через мембрану. Раствор с осмотическим давлением, равным внутриклеточному, называют изоосмотическим (изотоническим), растворы с осмотическим давлением, большим, чем у внутриклеточного содержимого, называют гипертоническими, с меньшим – гипотоническими.
Принимая, что основной компонент внутриклеточного содержимого –0,15 МKCl, осмолярность изотонического раствора определяем равной 0,3 осмол = 300 мосмол (для сравнения, так называемый физиологический раствор –0,15 МNaCl, или 0,9 %).
Осмолярность играет важную роль в растительных и животных клетках, определяя движение воды и растворенных веществ в клетки и межклеточные структуры. Клетки и межклеточные органеллы помещенные в среды, осмолярность которых отличается от изотонической, могут подвергаться осмотическому разрушению.
Существует целый ряд физиологических изотонических солевых растворов, содержащих NaCl, KCl, MgSO4 , CaCl2, KHPO4, другие соединения, необходимые для функционирования изолированных тканей, клеток, клеточных органелл, и напоминающих по своему составу плазму крови или внутриклеточное содержимое – среды Кребса – Рингера, Хэнкса и другие.
Устойчивость к варьированию внешних условий и стабильность клеточных мембран во многом определяют функционирование клетки, поскольку нарушение целостности мембраны приводит к клеточной гибели по некротическому (или апоптотическому) механизму. В частности, нарушение устойчивости и разрушение плазматической мембраны эритроцитов в сосудистом русле является причиной гемолитических состояний и нарушений микроциркуляции.
Изменения осмолярности среды индуцируют регуляторные изменение объема клетки (в частности, эритроцита), связанные с потоками растворителя и клеточных анионов и катионов через мембрану. Регуляция потоков клеточных осмолитов связана со спецефическим изменением проницаемости мембраны, участвует в регуляцииклеточного объема.
Эритроцит, помещенный в гипоосмотическую среду, лизирует при критическом объеме 150 мкм3 независимо от скорости растяжения мембраны и температуры. Следует отметить, что скорость гемолиза зависит от отношения площади мембранной поверхности к объему клетки, фосфолипидного и белкового состава мембраны, взаимодействия мембранных белков и липидного бислоя, скорости истечения внутриклеточных осмолитов.
Цель работы: определить зависимость объема клеток (эритроцитов) от осмолярности среды, изучить процесс разрушения эритроцитов в гипоосмотической среде, определить критический гемолитический объем эритроцитов и рассчитать площадь мембранной поверхности эритроцитов.
Реактивы: эритроциты крысы, хлорид натрия.
Оборудование: спектрофотометр СФ–46 (ЛОМО), автоматические пипетки объемом 10 – 100 мкл и 200 – 1000 мкл, пробирки, спектрофотометрические кюветы, весы аналитические.
Ход работы
1. Приготовим физиологический (изотонический) раствор NaCl –0,15 МNaCl (1 л).
2. Изолируем эритроциты крысы, промывая кровь0,15 Мраствором NaCl, центрифугируя (3000 об/мин, 5 мин) и удаляя слой, содержащий белки плазмы и другие форменные элементы крови.
3. Приготовим суспензию эритроцитов в 0,15 МNaCl с гематокритом 10 % (гематокрит – объем, занимаемый эритроцитами в суспензии или крови).
4. Приготовим серию, растворов NaCl изменяющейся осмолярности:
|
№ п/п |
NaCl, М |
Д760 |
|
1 |
0 |
|
|
2 |
0,06 М |
|
|
3 |
0,08 М |
|
|
4 |
0,09 М |
|
|
5 |
0,10 М |
|
|
6 |
0,15 М |
|
5. В 2 мл раствора NaCl различной осмолярности внесем 50 мкл суспензии эритроцитов, осторожно перемешаем.
6. Через 10 мин инкубации суспензий эритроцитов в средах с различной осмолярностью, измерим величину оптической плотности суспензии при длине волны 700 нм. Данные внесем в таблицу. Величина Д700 пропорциональна интенсивности рассеяния света суспензией эритроцитов, которая, в свою очередь, определяется числом целых клеток. Таким образом, величина Д700 зависит от степени гемолиза эритроцитов.
7. Строим график зависимости величины оптической плотности Д700 суспензии эритроцитов от концентрации NaCl. Определяем значение концентрации NaCl, соответсвующее 50% -му гемолизу эритроцитов (С50).
8. Рассчитаем критический гемолитический объем (объем, превышение которого разрушает клетку)
V* = Vнеакт. + Vакт. ∙ Сизоосм./ С50.
Известно, что объем максимально набухшей клетки (критический гемолитический объем) V* представляет сумму осмотически активного объема, зависящего от осмолярности среды Vакт , и осмотически неактивного объема Vнеакт.
Vакт. + Vнеакт. = V0.
Известно, что для эритроцита V0 = 9,8 ∙ 1010 нм3
Осмотически активный объем Vакт. составляет 70 % от объема клетки (в изоосмотической среде) и зависит от осмолярности среды.
9. Рассчитаем для изоосмотической среды
Vакт. = 0,7 ∙ 9,8∙1010 нм 3,
Vнеакт. = 0,3 ∙ 98∙1010 нм 3.
10. Определив критический гемолитический объем V*, рассчитаем радиус максимально набухшей клетки
V* = 4/3 π r 3,
r = 3√3 V*/ 4 π.
Определяем площадь поверхности клетки
S = π r 2.