ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА № 10  

Ферментативный гидролиз крахмала 

Фермент амилаза, содержащийся в слюне, соке поджелудочной железы, крови, печени, мозге, катализирует гидролиз крахмала. Последовательно процесс расщепления крахмала можно представить следующим образом.

 

 

Реактивы: раствор слюны (свежую слюну разводят дистиллированной водой в 5 раз); 1 %-й раствор крахмала; раствор иода в иодиде калия (1 г KI растворяют в нескольких миллилитрах воды. В концентрированном растворе соли растворяют 1 г иода и разбавляют водой до 300 см³.); 5 %-й раствор гидроксида натрия; 5 %-й раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки; водяная баня.

 

Ход работы

Задание 1. Гидролиз крахмала.

1. В две пробирки налейте по 2 см³ 1 %-го раствора крахмала.

2. В одну пробирку долейте 1 см³ разведенной слюны, а в другую – 1 см³ воды (для контроля) и поставьте пробирки на 10 мин в водяную  баню  или  термостат,  нагретые  до 37 – 38 ^оС (внимательно следите за температурой, не допуская ее повышения).

3. По окончании реакции проанализируйте содержимое пробирок на содержание крахмала и мальтозы, как указано в заданиях 2 и 3.

Задание 2. Обнаружение продуктов гидролиза крахмала.

1. Из опытной и контрольной пробирок задания 1 отлейте в отдельные пробирки по 1 см³ растворов.

2. Добавьте в каждую пробирку по 1 капле раствора иода и перемешайте.

3. Сравните окраску полученных растворов.

Задание 3. Обнаружение мальтозы.

1. К оставшимся растворам опытной и контрольной пробирок добавьте по 1 капле раствора сульфата меди и по 5 капель раствора щелочи.

2. Содержимое пробирок перемешайте и поместите их в кипящую водяную баню.

3. Сравните окраску полученных растворов.

Оформление результатов:

Запишите схемы частичного и полного гидролиза крахмала. Объясните полученные результаты заданий 2 и 3.

 

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА № 11 

Инактивация ферментов высокой температурой 

Поскольку ферменты являются белками, они весьма чувствительны к температуре, при которой протекает реакция. Температурный оптимум действия ферментов теплокровных животных составляет 37 – 38 ^оС. При небольшом повышении температуры скорость ферментативных реакций вначале повышается, но уже при дальнейшем нагревании (выше 50 ^оС) падает, а при 70 – 80 ^оС утрачивается.

Реактивы: раствор слюны (cвежую слюну разводят водой в 5 раз); 1 %-й раствор крахмала; раствор иода в иодиде калия (см. работу № 11); 5 %-й раствор гидроксида натрия; 5 %-й раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки; водяная баня.

Ход работы

Задание № 1

1. В две пробирки налейте по 1 см³ разведенной слюны.

2. Содержимое одной пробирки нагрейте до кипения и прокипятите 2 – 3 мин.

3. Затем в обе пробирки добавьте по 1 см³ раствора крахмала и поставьте их на 10 мин в водяную баню, нагретую до 38 ^оС.

 

Задание 2.

Из опытной и контрольной пробирок задания 1 отлейте в отдельные пробирки по 1 см³ их содержимого.

1. Добавьте в каждую пробирку по 1 капле раствора иода и тщательно перемешайте.

2. Сравните окраску полученных растворов.

 

Задание 3. Обнаружение мальтозы.

1. К оставшимся растворам опытной и контрольной пробирок добавьте по 1 капле раствора сульфата меди и по 5 капель раствора щелочи.

2. Содержимое пробирок перемешайте и поместите их в кипящую водяную баню.

3. Сравните окраску полученных растворов.

Оформление результатов

Объясните полученные результаты заданий 2 и 3. Сделайте вывод о влиянии температуры на активность ферментов.

 

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА 12 

Влияние рН среды на активность амилазы слюны 

Каждый фермент проявляет максимум своего каталитического действия при строго определенном рН среды.

Реактивы: раствор слюны (свежую слюну разводят водой в 100 раз); 0,5 %-й раствор крахмала;0,1 М раствор лимонной кислоты;0,2 М раствор гидрофосфата натрия; раствор иода в иодиде калия (см. работу № 11).

Оборудование: пробирки; водяная баня; пипетки.

Ход работы

1. В 7 пронумерованных пробирок налейте растворы лимонной кислоты и гидрофосфата натрия в количествах, указанных в таблице, получая, таким образом, буферные смеси со значениями рН от 5.6 до 8,0.

2. В каждую пробирку добавьте 10 капель 1 %-го раствора хлорида натрия, 10 капель 0,5 %-го раствора крахмала и 10 капель раствора слюны. 

№ пробирки	Объем 0,2 Мраствора Na2HPO4, см3	Объем 0,1 Мраствора лимонной кислоты, см3	рН буферной смеси	Окраска раствора после добавления иода
1	0,58	0,42	5,6
2	0,63	0,37	6,0
3	0,69	0,31	6,4
4	0,77	0,23	6,8
5	0,87	0,13	7,2
6	0,94	0,06	7,6
7	0,97	0,03	8,0

 1. Содержимое хорошо перемешайте и поставьте пробирки в водяную баню при температуре 37 – 38 ^оС.

2. Через 10 мин пробирки быстро охладите и добавьте в каждую пробирку по капле раствора иода.

3. Содержимое пробирок перемешайте и сравните окраску полученных растворов.

Оформление результатов:

Результаты исследования оформите, заполнив вышеприведенную таблицу. Установите, при каком рН произошло наиболее полное расщепление крахмала (желтая или буровато-желтая окраска с иодом).

 

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ  работа 13

Определение активности каталазы 

Каталаза – фермент, катализирующий реакцию расщепления пероксида водорода с образованием кислорода и воды. За ходом реакции можно следить по объему выделившегося кислорода.

Реактивы и материалы: растительный материал (листья или корни хрена, свежепророщенные семена или клубень картофеля); мел; 3 %-й раствор пероксида водорода.

Оборудование: установка для сбора газа (рис.37); ступка с пестиком; стакан.

 

Рис. 37.  Газометрический   прибор   для   определения   активности   каталазы.  1 – реакционная колба; 2 – зажим; 3 – бюретка  с  делениями; 4 – сосудик  для  раствора пероксида водорода; 5 –  делительная воронка.  Стеклянные  части прибора соединены резиновой трубкой.

 

Ход работы

1. Растительный материал (0,5 г) разотрите в ступке с 20 см³ дистиллированной воды с добавлением небольшого количества мела (для создания слабощелочной среды). Оптимальное значение рН для каталазы составляет 7,7.

2. Гомогенат ткани оставьте на 5 – 10  мин для отстаивания и затем полученный раствор перенесите в реакционную колбу (1).

3. В небольшой сосудик (4) влейте 5 см³ 3 %-го раствора пероксида водорода и осторожно пинцетом поставьте его внутрь реакционной колбы (1).

4. При открытом зажиме (2) осторожно плотно закройте реакционную колбу (1) пробкой газометрического прибора.

5. Закройте зажимом (2) сообщение с атмосферой и одновременно переверните сосудик (4) с перекисью внутри реакционной колбы (1). Пероксид смешивается с гомогенатом, содержащим каталазу, что вызовет разложение пероксида и выделение кислорода.

6. Выделяющийся кислород, попадая сверху в бюретку (3), будет отжимать воду вниз. По понижению уровня воды в бюретке судят об объеме выделившегося кислорода. Для того чтобы выровнять давление выделяющегося кислорода с атмосферным давлением, необходимо выровнять уровни воды в бюретке и воронке (5), опуская воронку (5) вниз.

7. Определите объем выделившегося кислорода через разные промежутки времени от начала реакции (1, 2, 3, 4, 5 мин).

8. Рассчитайте активность каталазы по фрмуле

 

где A – активность каталазы, см³/г*мин.; m – масса навески ткани, г; t – время, мин. Найдите среднее значение.

Оформление результатов:

Результаты проведенного исследования оформите в виде таблицы.

Время, мин	Объем кислорода, см3	Масса навески растительного сырья, г	Активность каталазы

Упражнения и задачи

 1. Фосфатазы катализируют гидролиз фосфорных эфиров. В частности, их субстратом является пара-нитрофенилфосфат (пНФФ): 

  

Образующийся в результате реакции паранитрофенол в щелочной среде имеет желтую окраску. По интенсивности окраски раствора определяют количество образовавшегося продукта реакции. Используя эти данные, рассчитывают скорость ферментативной реакции.

 

a) Используя табличные данные, постройте график зависимости скорости ферментативной реакции, катализируемой фосфатазой, от концентрации субстрата. 

Определите К_М и V_max.

 

b) На основании данных о скорости ферментативной реакции при различных значениях рН, представленных в таблице, постройте график зависимости скорости ферментативной реакции от рН. 

Определите рН-оптимум фосфатазы.

 

с) Постройте график зависимости скорости ферментативной реакции от температуры. Данные о скорости ферментативной реакции при различных значениях температуры представлены в таблице. 

Определите температурный оптимум фосфатазы

 

d) Конкурентным ингибитором фосфатаз является фосфат. Постройте графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фосфата. Данные представлены в таблице. 

Определите К_М и V_max ферментативной реакции в присутствии и в отсутствие конкурентного ингибитора. Сделайте вывод, каким образом фосфат влияет на эти показатели.

 

e) Фторид является неконкурентным ингибитором фосфатаз. Постройте графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фторида. Данные представлены в таблице. 

Определите К_М и V_max ферментативной реакции в присутствии и в отсутствие конкурентного ингибитора. Сделайте вывод, каким образом фторид влияет на эти показатели.

 

2) Карбоангидраза – один из самых активных ферментов – катализирует обратимую реакцию гидратации СО₂:

В эксперименте было установлено, что 10 мкг чистой карбоангидразы катализирует гидратацию 0,3 гСО₂ при 37 ^оС за 1 мин. Также методом гель-хроматографии установлено, что молярная масса карбоангидразы равна 30 000 г/моль. Рассчитайте число оборотов карбоангидразы. Числом оборотов фермента называется число молекул субстрата, претерпевающих превращение за 1 мин в расчете на 1 молекулу фермента. Ответ: 2*10⁷.

 

3) Уреаза повышает скорость гидролиза мочевины в 10¹⁴ раз. Рассчитайте, сколько бы потребовалось лет для гидролиза мочевины без уреазы, если под действием уреазы данное количество мочевины гидролизуется за 5 секунд. Ответ: 1,6*10⁷ лет.