Работа 4. Наблюдение за перераспределением калия при движении устьиц
В основе движения замыкающих клеток лежит изменение осмотического давления в самих замыкающих клетках и прилегающих к ним клетках эпидермы. Исследования последних лет показали, что ведущую роль в этом процессе играет работа калиевых ионных насосов, обеспечивающих перераспределение калия между этими двумя группами клеток. Увеличение осмотического давления в замыкающих клетках при открывании устьиц связано с поступлением в них калия, закрывание устьиц происходит при выходе калия из замыкающих клеток. Поэтому в открытых устьицах замыкающие клетки намного богаче ионами калия, чем в закрытых. Эти различия можно выявить гистохимически кобальтнитритным методом.
Метод основан на взаимодействии кобальтнитрита натрия с ионами калия в ткани:
При этом о6разуется желтый кристаллический осадок соли K2Na[Co(NO2)6]. Для более четкого обнаружения препарат обрабатывают сульфидом аммония, что приводит к образованию в местах локализации калия коричневого осадка сульфида кобальта.
Материалы и оборудование. Традесканция, 7 – 10-дневные проростки овса, кукурузы, бобов, готовые к работе, среда инкубации, дистиллированная вода, 50 %-й глицерин, насыщенный раствор сульфида аммония, предметные стекла, покровные стекла, чашки Петри, бюксы, стеклянные палочки, сосуды со снегом или льдом, скальпель, пинцет анатомический, препаровальные иглы, микроскопы «Биолам 70-Р».
Подготовка к опыту растительного материала. За 1,5 – 2 ч до начала опыта одну часть растений поливают и выставляют на яркий свет, другую – выдерживают в темноте до полного закрывания устьиц. Полностью открытые устьица можно также получить на листовых сегментах: за 1 ч до опыта нарезают полоски листа и помещают их в освещенные настольной лампой чашки Петри с водопроводной водой.
Приготовление среды инкубации. Растворяют 20 г нитрата кобальта и 35 г нитрата натрия в 75 см3 подкисленной дистиллированной воды (10 см3 ледяной уксусной кислоты доводят до 75 см3 дистиллятом). Смесь фильтруют и доводят дистиллятом до 100 см3. Работать лучше со свежеприготовленной смесью. При необходимости ее можно хранить в холодильнике в течение месяца.
Ход работы. На нижней стороне подготовленных к опыту листьев или сегментов острой бритвой под прямым углом к центральной жилке сделайте поверхностные надрезы через 2-3 мм и срежьте в этом же направлении небольшие участки эпидермиса. Подготовленные эпидермальные полоски поместите на 1-2 мин в чашки Петри с охлажденной дистиллированной водой с тем, чтобы удалить внеклеточный калий. Затем перенесите на 5 мин в бюкс с охлажденной инкубационной средой и промойте в чашке Петри охлажденной дистиллированной водой 2-3 мин.
Так как кристаллы натриево-калиевой соли кобальтоазотистой кислоты при комнатной температуре относительно растворимы, чашки Петри с водой и бюкс с инкубационной средой поместите в сосуд со снегом или льдом. Подготовленные препараты просмотрите под микроскопом в смеси 50 %-го глицерина и насыщенного раствора сульфида аммония, взятых в соотношении 1:1. Зарисуйте локализацию калия в замыкающих и прилегающих к ним клетках эпидермиса при открытых и закрытых устьицах.