Лабораторная работа №57
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ МОЧЕВИНЫ
В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
За сутки человек выделяет с мочой 25 –30 гмочевины, азот которой составляет 85 – 93 % общего количества азота мочи. Количество мочевины находится в зависимости от содержания белков в пище, так как она является одним из важнейших продуктов белкового обмена. Выделение мочевины с мочой увеличивается при распаде белков в организме.
Уреаза (карбамид – амидогидролаза) принадлежит к ферментам группы амидаз. По химической природе относится к глобулинам. Уреаза расщепляет мочевину до аммиака и угольной кислоты. Схематически это может быть представлено следующим образом:
Выделившийся аммиак определяют фотометрически по окрашенному продукту химической реакции.
Реактивы: препарат уреазы (реактив 1), хромоген–раствор, содержащий6 г салицилата натрия и0,13 г нитропруссида натрия в 100 мл дистиллированной воды (реактив 2), натрия гипохлорит (реактив 3), калибровочный раствор мочевины 10,0 ммоль/л (реактив 4)
Оборудование: спектрофотометр СФ–46 (ЛОМО), автоматические пипетки объемом 10 – 100 мкл и 200 –1000 мкл, пробирки, спектрофотометрические кюветы, термостат.
Ход работы
Анализ проводят по следующей схеме:
|
Компоненты реакционной смеси |
Опытная проба, мл |
Проба сравнения, мл |
Эталон, мл |
||
|
Реактив 1 |
0,50 |
0,50 |
0,50 |
||
|
Реактив 4 |
– |
– |
0,02 |
||
|
Проба биологической жидкости* |
0,02 |
– |
– |
||
|
Перемешивают и инкубируют 10 мин при 37 оС |
|||||
|
Реактив 2 |
1 |
1 |
1 |
||
|
Реактив 3 |
1 |
1 |
1 |
||
|
Повторно инкубируют 5 мин при 37 оС или 15 мин при комнатной температуре |
|||||
Проба биологической жидкости* – плазма, сыворотка крови, моча (мочу перед анализом разводят дистиллированной водой в соотношении 1:100).
Измеряют оптическую плотность (длина волны 590 нм) опытной пробы (Dопыт) и эталонной пробы (Dэталон) относительно пробы сравнения. Концентрацию мочевины в исследуемой жидкости (Сопыт) в ммоль/л рассчитывают по формуле:
Сопыт=Сэтал / Dэтал* Dопыт.
При определении мочевины в моче результат умножают на коэффициент разведения.
Физиологические значения содержания мочевины:
в сыворотке крови 2,61 – 8,35 ммоль/л,
в суточном объеме мочи 333,0 – 582,8 ммоль/л.