Раздел 3. Перспективы создания и применения трансгенных животных

 

Для успешного освоения данного раздела студенту рекомендуется обратить внимания на векторные системы для введения генетической информации в клетки млекопитающих и метод введения генетической информации в организм млекопитающих с использованием эмбриональных стволовых клеток. Также необходимо изучить методы отбора трансфецированных эмбриональных стволовых клеток (позитивно-негативная селекция) и идентификации несущих интродуцированный ген клеток (ПЦР-анализ). Для данных наиболее сложных тем представлены рисунки 6-9.

Студенту следует рассмотреть, в чем заключаются различия между векторными системами для введения генетической информации в клетки млекопитающих на основе ретровирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса простого герпеса, микрохромосом и искусственных хромосом дрожжей.

Рекомендуется  проанализировать и охарактеризовать каждую из невирусных систем доставки ДНК в клетки млекопитающих: инъекции суспензий молекул ДНК в ткани, бомбардировка частицами золота, применение липосом (липоплексы), использование эндосомного транспорта.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенную яйцеклетку животных, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие модифицированный ген и передающие его потомкам. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы с полезными для человека признаками. Кроме чисто практической полезности генетической трансформации животных, она позволяет решать и некоторые фундаментальные вопросы. Например, она может оказать большую помощь в установлении роли отдельных генов и их белковых продуктов, как в регуляции активности других генов, так и в различных патологических процессах.

Векторные системы для введения генетической информации в клетки млекопитающих на основе ретровирусов

Преимущество метода, основанного на использовании ретровирусных векторов (рисунок 6), перед другими методами трансгеноза состоит в его эффективности. Но размер вставки ограничивается 8 т. п. н., вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии. Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным   ретровирусом,   несущим   трансген. Самки, которым был имплантирован эмбрион («суррогатные» матери), производят на свет трансгенное потомство.

 

Рисунок 6 – Получение линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов

 

Метод введения генетической информации в организм млекопитающих с использованием эмбриональных стволовых клеток

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ES). ES-клетки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных (рисунок 7).

 

Рисунок 7 – Получение трансгенных мышей с помощью генетической мо­дификации эмбриональных стволо­вых (ES) клеток

 

ES-клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши. Их трансфицируют вектором, несущим трансген, культивируют и идентифицируют трансфицированные клетки методом по­зитивно-негативной селекции или ПЦР. Популяцию трансфицированных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку «суррогатных» матерей.

Методы отбора трансфецированных эмбриональных стволовых клеток (позитивно-негативная селекция)

Рисунок 8 – Позитивно-негативная селекция А. Неспецифическая интеграция. В хромосому встроились оба гена тимидинкиназы (tk1 и tk2), два участка ДНК, гомологичные специфичным последовательностям хромосомной ДНК репипиентных клеток (НВ1 и НВ2), ген (Neor), обеспечивающий устойчивость к цитотоксическому соединению G-418, и трансген (TG). После трансфекции проводят тестирование клеток на устойчивость к G-418 и ганцикловиру, который становится цитотоксичным для клеток, синтезирующих тимидинкиназу. Интеграция может произойти и по-другому, со встраиванием в хромосому только гена тимидинкиназы. В присутствии G-418 и ганцикловира все такие клетки тоже погибают. Б. Специфическая интеграция с помощью гомологичной рекомбинации. В результате двойного кроссинговера между гомологичными участками (НВ1 и НВ2) векторной и хромосомной ДНК в последнюю встраивается фрагмент, не содержащий генов тимидинкиназы (tk1 и tk2). В присутствии G-418 и ганцикловира выживают только клетки, в которых прошла гомологичная рекомбинация. Метод идентификации несущих интродуцированный ген клеток (ПЦР-анализ) Более простой способ идентификации ES-клеток, несущих трансген в нужном сайте, основан на использовании ПЦР. В этом случае ДНК-вектор содержит два участка, гомологичных сайту-мишени, по одному со стороны трансгена и со стороны клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) последовательности, отсутствующей в геноме мыши (рисунок 9). После трансфекции ES-клеток этим вектором проводят скрининг трансфицированных клеток методом ПЦР. Один из ПЦР-праймеров (Р1) комплементарен участку клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) нуклеотидной последовательности интегрировавшего вектора, а второй (Р2) — участку хромосомной ДНК, прилегающему к одному из гомологичных участков ДНК. При встраивании последовательности-мишени в случайный сайт ожидаемый продукт амплификации образовываться не будет (рисунок 9 А), а при сайт-специфической интеграции в результате ПЦР-амплификации образуется фрагмент ДНК известного размера (рисунок 9 Б). Таким образом, можно идентифицировать пулы ES-клеток, содержащих трансген в нужном сайте, а пересевая клетки из этих пулов — получить клеточные линии с сайт-специфической вставкой.

Рисунок 9 – Идентификация клеток, несущих трансген в специфическом сайте, при помощи ПЦР А. В результате неспецифического встраивания векторной ДНК один из праймеров (Р2) не сможет гибридизоваться с участком хромосомы, находящимся на определенном расстоянии от места отжига праймера Р1, и фрагмента нужного размера при амплификации не образуется. Р1 гибридизуется с уникальным участком (US) встроенной ДНК, отсутствующим в хромосомной ДНК клетки-реципиента. Б. В результате гомологичной рекомбинации между участками НВ1 и НВ2 встраиваемой ДНК, с одной стороны, и комплементарными участками хромосомы CS1 и CS2, с другой, образуются участки, с которыми могут гибридизоваться оба праймера, Р1 и Р2, и которые находятся на определенном расстоянии друг от друга. В ходе ПЦР-амплификации синтезируются фрагменты одного размера, которые можно идентифицировать при помощи гель-электрофореза. Если ПЦР-продукт нужной длины образовался, значит трансген (TG), находящийся между гомологичными участками (НВ1 и НВ2), встроился в определенный сайт хромосомы. Вопросы для управляемой самостоятельной работы: 1. Получение трансгенных лабораторных мышей и их применение. 2. Получение и перспективы применения трансгенного крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, птиц и рыб.

Вопросы для самоконтроля:

1. Дайте определение понятию «бакуловирус».

2. Опишите механизм репродукции бакуловирусов в организмах членистоногих.

3. Для чего используются культуры клеток насекомых и чем это обусловлено?

4. Дайте характеристику вируса множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV).

5. Опишите конструкцию транспортного вектора рекомбинантного бакуловируса AcMNPV.

6. Дайте определение понятию «бакмида».

7. Для чего применяют аффинные метки?

8. Перечислите векторы, которые используются для переноса генов в животные клетки.

9. Приведите схему переноса генов с использованием ретровирусных векторов.

10. Расскажите о преимуществах использования аденовирусов в качестве вектора.

Литература: [1,2,3,6,8,9,12,13,14,15].