Раздел 1. Получение и применения трансгенных растений

 

При изучении данного раздела курса студент должен обратить внимание на феномен генетической колонизации растений бактериями рода Agrobacterium. Также необходимо уметьдатьструктурное и функциональное сравнение Т-ДНК плазмид октопинового и ноналинового типов. Изучить принцип конструирования и характеристику промежуточных (коинтегративных) векторов на основе Ті - плазмид. В данном пособии содержится материал по данным темам с рисунками 1-3 для более глубокого понимания.

В этом разделе студенту также необходимо освоить методы введения генетической информации в растения с помощью агробактерий, и возможности использования вирусов растений для создания векторных систем. Изучить такие методы как: трансформация, кокультивация, биобаллистика, электропорация, микроинъекций.

Растения обладают таким важным свойством, как тотипотентность, которое раскрывает для молекулярных биологов большие возможности по созданию трансгенных растений. Основной целью биотехнологических экспериментов на растениях является создание новых высокоурожайных сортов культурных растений без изменения их пищевой ценности. Исследования в этой области также направлены на обеспечение устойчивости растений к насекомым-вредителям, вирусам, гербицидам, неблагоприятным условиям окружающей среды.

Феномен генетической колонизации растений бактериями рода Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens вызывает образование опухолей у двудольных растений. Способность A. tumefaciens индуцировать у растений образование опухолей типа «корончатого галла» коррелирует с наличием у них Ti-плазмиды. Опухолевая трансформация проявляется в гипертрофии возникающей после проникновения агробактерий в пораненные участки растений (рисунок 1). Трансформация является результатом включения сегмента («transferred» или Т-ДНК) плазмиды (pTi - tumor inducing или pRi — root inducing) бактерий в ядерную ДНК растительной клетки.

 

 

1 - агробактерии существуют в ризосфере;

2 - строение A. tumefaciens;

3 - встраивание Т-ДНК в геном;

4 - образование опухоли.

Рисунок 1 – Генетическая колонизация растения A. tumefaciens

 

Структурное сравнение Т-ДНК плазмид октопинового и ноналинового типов

В ходе исследований выявлено наследуемое изменение в клетках корончатых галлов — это синтез опинов. Необычное для растений соединение, производное аргинина, обнаруженное лишь в определенных опухолевых линиях, было названо октопином. Затем было показано, что другими опухолевыми линиями синтезируется еще одно соединение — нопалин, также производное аргинина. В зависимости от типа индуцируемого в опухоли опина штаммы A. tumefaciens и находящиеся в них Ti-плазмиды получили соответствующее обозначение — октопиновые или нопалиновые.

В результате исследований обнаружено четыре основных области гомологии между октопиновой и нопалиновой плазмидами. Две консервативные области (А и D) вовлечены в онкогенность, еще одна (В) соответствует области контроля репликации плазмиды, в то время как последняя (С) кодирует функции конъюгативного переноса (рисунок 2). Кроме Т-ДНК в плазмидах имеется область, кодирующая функцию конъюгации (Tra), а также область репликации (Ori V) и область вирулентности (Vir).

 

 

Рисунок 2 – Структура Тi-плазмид нопалинового и октопинового типа

 

Принцип конструирования и характеристика промежуточных (коинтегративных) векторов на основе Ті- плазмид

Метод «промежуточных векторов» (коинтегративных векторов) служит для введения Ti-плазмидных последовательностей, содержащих нужный ген, в растение. Данный метод основан на использовании плазмиды кишечной палочки pBR 322 (рисунок 3).

Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду pBR 322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в большом количестве, то есть клонируют в кишечной палочке. Затем с помощью конъюгации вводят в клетки агробактерии, несущие полную Ti-плазмиду.

Между Т-сегментами нативной Ti-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Ti-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.

 

 Рисунок 3 – Создание коинтегративного вектора на основе Тi-плазмиды

 

Вопросы для управляемой самостоятельной работы:

1. Получение трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, насекомым-вредителям, вирусам, стрессовым воздействиям, с измененным цветом лепестков цветка.

2. Перспективы создания трансгенных растений, устойчивых к бактериальным и грибковым заболеваниям, с улучшенными пищевыми качествами, товарным видом, пригодных для получения вакцин и сывороток из растительного материала.

3. Возможности использования трансгенных растений и качестве источников сырья для парфюмерной, химической и текстильной промышленности.

Вопросы для самоконтроля:

1. Что подразумевается под термином генетическая колонизация?

2. Какая бактерия несет инфекционный фактор, приводящий к болезни «корончатый галл»? Охарактеризуйте заболевание.

3. Какие практические задачи выполняют плазмиды бактерий?

4. Как осуществляется перенос гипотетического гена с помощью Ti-плазмиды?

6. Какие требования предъявляются к векторной молекуле?

7. Какие недостатки Ti – плазмид?

8. Охарактеризуйте коинтегративный клонирующий вектор.

9. Дайте определение понятию бинарный вектор.

10. Благодаря каким особенностям вироиды рассматриваются в качестве потенциальных векторов?

Литература: [1,2,3,4,6,8,9,10,11,12,13,14,15,16].