Раздел 2. Получение и применения трансгенных дрожжей
В ходе изучения данного раздела студенту предлагается обратить внимания на строение эписомных экспрессирующих и интегрирующих векторов, а также наконструирование искусственных дрожжевых хромосом (YAC). Для лучшего понимания данных процессов в пособии приводятся рисунки 4 и 5.
В ходе изучения данного раздела студенту необходимо усвоить такие понятия как: вектор, плазмида, репликация, промотор, сайт терминации, сайт инициации, экспрессия, трансфекция.
Для экспрессии клонированных эукариотических генов используют довольно часто дрожжи Saccharomycescerevisiae. Одной из причин использования данного одноклеточного организма, это то, что его генетика и физиология детально изучены. Также, выделены и охарактеризованы несколько сильных промоторов этих дрожжей, а для систем эндогенных дрожжевых экспрессирующих векторов могут использоваться природные 2 мкм-плазмиды.
Поскольку дрожжи уже многие годы используют в хлебопечении и пивоварении, Департамент контроля качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США) включил S. cerevisiae в список «организмов, признанных безопасными» (GRAS, generallyrecognizedassafe). Таким образом, использование этих организмов для получения белков, применяемых в медицине, не требует дополнительных экспериментов, необходимых при работе с неразрешенными к применению микроорганизмами.
Интегрирующий вектор для получения трансгенных Pichiapastoris
Рисунок 4 – Интегрирующий экспрессирующий вектор для P. pastoris
Между промотором (AOXlp) и сигналом терминации-полиаденилирования (AOXIt) гена алкогольоксидазы 1 P. pastoris встроен ген HBsAg. HIS4— ген, кодирующий один из ферментов биосинтеза гистидина, гистидинолдегидрогеназу. Кроме того, вектор содержит сайт инициации репликации Р. pastoris (оripp), ген устойчивости к ампициллину (Аmpr) и сайт инициации репликации, активный в Е. coli (оriЕ). 3'-AOX1 — это фрагмент 3'-концевой последовательности гена алкогольоксидазы 1 P. pastoris. Стрелками указан сегмент, который интегрируется в геном P. pastoris.
Конструирование искусственных дрожжевых хромосом (YAC)
Рисунок 5 – YAC-система клонирования
YAC-плазмида (pYAC) содержит селективный маркерный генE. coli (Ampr), сайт инициации репликации, функционирующий в E. coli (oriE); сегмент дрожжевой ДНК, включающий участки URA3, CEN, TRP1 и ARS (CEN - последовательность, выполняющая центромерную функцию, ARS– дрожжевая автономно реплицирующаяся последовательность, эквивалентнаядрожжевому сайту инициации репликации, URA3 — один из генов биосинтеза урацила,TRP1 - один из генов биосинтеза триптофана). Т — это теломерные области дрожжевой хромосомы, SmaI — сайт, по которому осуществляется клонирование. pYAC сначала обрабатывают SmaI, ВатHIи щелочной фосфатазой, а затем сшивают с фрагментом ДНК длиной 100 т. п. н. Конечная генетическая конструкция содержит клонированную ДНК и может стабильно поддерживаться в дрожжевых клетках Ura-Trp-.
Вопросы для управляемой самостоятельной работы:
1. Особенности физиологии и культивирования одноклеточных грибов.
2. Преимущества дрожжей как продуцентов биологически активных веществ в сравнении с прокариотическими микроорганизмами.
Вопросы для самоконтроля:
1. Почему выгодно использование в генной инженерии дрожжей Saccharomyces cerevisiae для экспрессии клонируемых эукариотических генов?
2. Какие еще виды дрожжей, кроме Saccharomyces cerevisiae используются в генной инженерии?
3.Какиеэкспрессирующие векторы существуют для
Saccharomycescerevisiae?
4. Дайте характеристику вектору, который сконструирован на основе 2 мкм-кольцевой плазмиды дрожжей.
5. Нарисуйте интегрирующий экспрессирующий вектор дляPichiapastoris.
6. Опишите механизм осуществления переноса генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом.
Литература: [1,2,3,6,8,9,12,13,14,15].