ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА № 5 

Цветные реакции на белки

 

Присутствие белков в биологических объектах или растворах можно определить с помощью цветных реакций, протекание которых обусловлено наличием в белке специфических групп и пептидных связей.

Реактивы: водный раствор яичного белка (белок одного куриного яйца отделяют от желтка, растворяют в 15–20-кратном объеме дистиллированной воды, затем раствор фильтруют через марлю,  сложенную в  3 – 4  слоя, и  хранят  в  холодильнике.); 10 %-й раствор гидроксида натрия; 30 %-й раствор гидроксида натрия; 1 %-й раствор сульфата меди; 1 %-й раствор ацетата свинца; концентрированная азотная кислота.

Оборудование: пробирки; водяная баня или спиртовка.

 

Задание 1. Биуретовая реакция.

В щелочной среде белки, а также продукты их гидролиза – пептиды, дают фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание с солями меди. Реакция обязана наличию пептидных связей в белках:

Интенсивность окраски зависит от длины полипептида.

 

Ход работы

1. В пробирку налейте 5 капель раствора яичного белка, затем  10 капель 10 %-го раствора щелочи.

2. Добавьте 1 – 2  капли раствора сульфата меди, смесь перемешайте. Появляется красно-фиолетовое окрашивание.

 

Задание 2. Ксантопротеиновая реакция.

Реакция характерна для некоторых ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана), а также для пептидов, их содержащих. При действии азотной кислоты образуется нитросоединение желтого цвета. Далее нитропроизводные могут реагировать со щелочью с образованием натриевой соли, имеющей желто-оранжевое окрашивание:

  

Ход работы

Данную работу необходимо выполнять в вытяжном шкафу, соблюдая особую осторожность!

1. В пробирку налейте 5 капель раствора яичного белка и ОСТОРОЖНО по стенке прибавьте 3 – 4  капли концентрированной азотной кислоты.

2. Смесь осторожно нагрейте. Выпадает осадок желтого цвета.

3. После охлаждения в пробирку ОСТОРОЖНО по стенке прилейте 10 капель 30 %-го раствора NaOH, желтая окраска переходит  в оранжевую.

 

Задание 3. Реакция на серусодержащие аминокислоты.

В остатках серусодержащих аминокислот цистеина и цистина сера при щелочном гидролизе отщепляется, образуя сульфиды. Сульфиды, взаимодействуя с ацетатом свинца, дают осадок сульфида свинца черного или буро-черного цвета.

 

Ход работы

1. В пробирке смешайте 5 капель раствора яичного белка, 5 капель 30 %-го раствора щелочи и 2 капли раствора ацетата свинца.

2. Смесь осторожно нагрейте на спиртовке до кипения и кипятите. Через некоторое время появляется буровато-черное или черное окрашивание.

Оформление результатов

Оформите проведенные исследования в виде таблицы. 

№ задания	Условия проведения реакции	Наблюдаемое явление	Протекающие реакции	Вывод

 

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА № 6 

Реакции обратимого осаждения белков

Реакции осаждения белков бывают обратимыми и необратимыми.

При обратимом осаждении макромолекулы белка в основном не подвергаются глубокой денатурации, а осадки могут быть снова растворены в первоначальном растворителе. Обратимое осаждение вызывается действием нейтральных солей аммония, щелочных и щелочно-земельных металлов (высаливание), спирта, ацетона, эфира и некоторых других органических растворителей.

Реактивы: раствор яичного белка с добавлением хлорида натрия (белок одного  куриного яица отделяют от желтка и растворяют в 230 см³ дистиллированной воды, к которой прибавляют 100 см³ насыщенного раствора хлорида натрия, раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3 – 4 слоя, и хранят в холодильнике); насыщенный раствор сульфата аммония; сульфат аммония, растертый в порошок; 10 %-й раствор гидроксида натрия; 1 %-й раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки; воронка для фильтрования; бумажные фильтры.

Ход работы

Задание 1. Осаждение белков сульфатом аммония.

1. В пробирку отмерьте 2 – 3  см³ раствора яичного белка, добавьте равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и смесь перемешайте.

2. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтруйте на бумажном фильтре.

3. К фильтрату добавьте порошок сульфата аммония до получения насыщенного раствора (последняя порция не растворяется).

4. Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтруйте.

5. Фильтр с осадком альбулинов промойте 5 см³ воды, собирая фильтрат в чистую пробирку.

6. Проделайте с фильтратом биуретовую реакцию. Произошло ли растворение альбулинов?

 

Задание 2. Осаждение белков спиртом.

Органические растворители вызывают осаждение белков вследствие разрушения гидратной оболочки макромолекул.

1. В пробирку налейте 1 см³ раствора яичного белка с добавлением хлорида натрия.

2. По каплям прилейте 4 – 6  см³ спирта и сильно взболтайте. Через 5 – 8  мин выпадает осадок белков.

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ работа № 7

Реакции необратимого осаждения белков 

При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация белка. Денатурированный белок не способен к восстановлению своих первоначальных физико-химических и биологических свойств. Необратимое осаждение вызывается высокой температурой, действием концентрированных минеральных и некоторых органических кислот, ионов тяжелых металлов, алкалоидных реагентов, детергентов, красителей.

Реактивы: водный раствор яичного белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе № 6, часть 1); концентрированные серная, соляная и азотная кислоты; 5 %-й раствор ацетата свинца; 2,5 %-й раствор нитрата серебра; 5 %-й раствор сульфата меди.

 

Задание 1. Осаждение белков минеральными кислотами.

Реакция находит применение для быстрого определения белка в биологических жидкостях, например, моче.

Ход работы

Данную работу необходимо выполнять в вытяжном шкафу, соблюдая особую осторожность!

1. В три пробирки налейте по 15 – 20  капель концентрированных кислот: в первую – серной; во вторую – азотной и в третью – соляной.

2. Пробирки наклоните под углом 45^о и ОСТОРОЖНО (из пипетки) наслоите по стенке раствор белка. Пробирку держите отверстием от себя. На границе белка и кислоты появляется белое кольцо.

3. Пробирки осторожно встряхните. Осадки растворяются в серной и соляной кислотах, но не растворяются в азотной кислоте.

 

Задание 2. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Белки осаждаются солями меди, свинца, ртути, цинка, серебра и других тяжелых металлов. Свойство белков связывать ионы тяжелых металлов используется в медицине при оказании первой помощи пострадавшим от отравления солями меди, свинца, ртути.

Ход работы

1. В три пронумерованные пробирки налейте по 5 – 10  капель раствора белка.

2. В первую пробирку по каплям прибавьте раствор ацетата свинца. Образуется осадок. Добавьте еще несколько капель, осадок должен раствориться в избытке раствора соли.

3. Во вторую пробирку по каплям приливайте раствор нитрата серебра. Образовавшийся осадок в избытке соли не растворяется.

4. В третью пробирку прибавьте раствор сульфата меди до появления осадка. Убедитесь, что осадок растворяется в избытке соли.

Оформление результатов:

Оформите результаты проведенных исследований в виде таблицы.

Осаждающий реагент	Описание осадка	Растворимость осадка в избытке реагента

 

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА № 8

Тепловая денатурация белка. 

При нагревании белки денатурируют. На процесс денатурации оказывают сильное влияние рН раствора и добавление электролитов.

Реактивы: водный раствор яичного белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе № 6, часть 1); 1%-й раствор уксусной кислоты; 10 %-й раствор уксусной кислоты; 10 %-й раствор гидроксида натрия; насыщенный раствор хлорида натрия.

Оборудование: пробирки, водяная баня или спиртовка.

Ход работы

1. В пять пронумерованных пробирок налейте по 10 капель раствора яичного белка.

2. Белок в первой пробирке нагрейте до кипения. Раствор мутнеет (разрушаются гидратные оболочки вокруг макромолекул), но осадок не образуется. Мицеллы, образованные макромолекулами, сохраняют одноименный заряд, что препятствует их осаждению.

3. К раствору белка во второй пробирке добавьте одну каплю 1 %-го раствора уксусной кислоты и нагрейте до кипения. Осадок белка выпадает быстро. Заряд мицелл нейтрализован, и белок близок к изоэлектрической точке.

4. К раствору белка в третьей пробирке прибавьте 1 – 2 капли 10 %-го раствора уксусной кислоты  и нагрейте до кипения. Осадок не образуется, так как мицеллы белка приобрели, присоединяя ионы водорода, положительный заряд, что препятствует их осаждению.

5. В четвертую пробирку добавьте 1 – 2  капли 10 %-го раствора гидроксида натрия и нагрейте до кипения. Осадок не выпадает. Мицеллы за счет отщепления протонов от карбоксильных групп боковых цепей белка заряжены отрицательно.

6. В пятую пробирку прибавьте 1 – 2  капель насыщенного раствора хлорида натрия и нагрейте до кипения. Белок выпадает в осадок.

Оформление результатов

Оформите результаты исследования, заполнив таблицу и кратко записав механизм денатурирующего действия исследуемого фактора в виде вывода.

№ пробирки	Добавляемый электролит	Наблюдаемый эффект денатурации	Вывод

 

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ работа № 9 

Выделение казеина из молока 

Казеин – важнейший белок молока. Он относится к фосфопротеинам. Остатки фосфорной кислоты в молекуле казеина связаны с остатками серина.  При подкислении до рН 4,7 (изоэлектрическая точка казеина) белок выпадает в осадок.

Добавление избытка кислоты вызывает перезарядку белковых молекул и переход их снова в раствор.

Реактивы: молоко цельное обезжиренное; 10 %-й раствор уксусной кислоты; 1 %-й раствор гидроксида натрия; 5 %-й раствор сульфата меди.

Оборудование:  пробирки, воронка для фильтрования, бумажный фильтр.

 

Ход работы 

Задание № 1. Выделение казеина.

1. В пробирку внесите 2 см³ молока, прибавьте столько же дистиллированной воды и полученную смесь перемешайте.

2. К раствору прибавляйте по каплям  10 %-й раствор уксусной кислоты до образования осадка. Избегайте избытка кислоты.

3. Осадок отфильтруйте на бумажном фильтре и промойте несколько раз  дистиллированной водой (на фильтре).

4. Растворите осадок в 1 %-м растворе щелочи. Полученный раствор профильтруйте через смоченный водой фильтр.

Задание № 2. Качественная реакция на белок.

К 1 см³ профильтрованного раствора добавьте 1 каплю раствора сульфата меди. Образуется характерное для белков красно-фиолетовое окрашивание.

 

Оформление результатов

Опишите ход выполнения работы. Объясните наблюдаемые явления.

 

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА 

Диализ растворов белков 

Метод диализа основан на неодинаковой способности компонентов раствора к диффузии через тонкие пленки – мембраны. Мембрана представляет собой пористую пленку, через поры которой могут проникать небольшие молекулы. Метод диализа используется для очистки высокомолекулярных соединений от низкомолекулярных, а также концентрирования растворов полимеров.

Реактивы: водный раствор белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе № 6, часть 1); насыщенный раствор хлорида натрия; 0,5 %-й раствор нитрата серебра; 10 %-й раствор азотной кислоты; 10 %-й раствор гидроксида натрия; 1 %-й раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки, целлофановый мешочек; стакан.

Ход работы

Задание 1. Диализ.

1. В пробирке смешайте равные объемы раствора белка и насыщенного раствора хлорида натрия.

2. Влейте приготовленный раствор белка в мешочек из целлофана, заполнив его до половины.

3. Мешочек подвесьте на стеклянной палочке и погрузите в стакан с дистиллированной водой. Ионы натрия и хлорид-ионы свободно проникают через стенки мешочка и равномерно распределяются по всему объему воды. Молекулы белка имеют большие размеры, чем размеры пор целлофана, и остаются в мешочке. Диализ проводят при комнатной температуре в течение 20 мин.

 

Задание 2. Анализ воды в стакане.

1. К 1 см³ жидкости из стакана добавьте 2 капли раствора азотной кислоты и 2 – 3 капли раствора нитрата серебра. Появляется белый осадок хлорида серебра.

2. К 1 см³ жидкости из стакана добавьте 5 капель раствора щелочи и 1 – 2 капли раствора сульфата меди. Фиолетовое окрашивание, характерное для белков, отсутствует.

 

Задание 3. Анализ содержимого мешочка.

К 5 каплям раствора из мешочка добавьте 5 капель раствора щелочи и 1 – 2  капли раствора сульфата меди. Появляется характерное окрашивание, вызванное образованием комплексной соли меди с полипептидом.

Оформление результатов:

Коротко опишите ход выполнения работы. Сделайте схематический рисунок диализа. Сделайте вывод о распределении низко- и высокомолекулярных веществ до и после диализа.

 

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Определение изоэлектрической точки желатины 

В изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы.  Молекулы белка с одинаковым количеством положительных и отрицательных зарядов легко выпадают в осадок. Значение рН, соответствующее изоэлектрической точке, является характерным для каждого белка. Выпадение белка в осадок можно ускорить добавлением водоотнимающих веществ, например, этилового спирта.

Реактивы: 0,5 %-й раствор желатины;0,1 М раствор уксусной кислоты;0,1 М раствор ацетата натрия; 96 %-й этиловый спирт.

Оборудование: пробирки; мерные пипетки.

Ход работы

1. В пять пронумерованных пробирок прилейте растворы уксусной кислоты и ацетата натрия в количествах, указанных в таблице.

2. Затем в каждую пробирку добавьте по 1 см³ раствора желатины и хорошо перемешайте.

3. В каждую пробирку прибавьте по 4 см³ этилового спирта и снова перемешайте.

4. Через 5 –10 мин просмотрите все пробирки и оцените степень мутности полученных смесей. рН наиболее мутной смеси соо тветствует изоэлектрической точке желатины.

Оформление результатов

Результаты опыта оформите в виде таблицы. Определите изоэлектрическую точку желатины.

№ пробирки	Состав буферной смеси, см3		рН смеси	0,5 %-й раствор желатины, см3	Этиловый спирт, см3	Степень мутности (по 5-балльной шкале)
	0,1 М СH3COOH	0,1 M СH3COONa
1	1,8	0,2	3,8	1	4
2	1,4	0,6	4,4	1	4
3	1,0	1,0	4,7	1	4
4	0,6	1,4	5,1	1	4
5	0,2	1,8	5,7	1	4

 

 

Упражнения и задачи

1. Какой объем раствора гидроксида натрия с массовой долей NaOH 15 % и плотностью 1,16 г/см³ потребуется для реакции с раствором глицина массой 10 г c массовой долей аминокислоты 6 %? Ответ: 1,84 см³.

2. Какая масса раствора соляной кислоты с массовой долей HCl 5 %  потребуется для реакции с раствором аланина массой20 гc массовой долей аминокислоты 5 %? Ответ: 8,2 г.

3. Какая  масса  глицина может быть получена из карбида кальция? Масса карбида кальция равна 128 г. Потеpи составляют 15 %. Ответ: 127,5 г.

4. Напишите структурные формулы следующих олигопептидов: а) аланилглицин; б) глицилаланиллейцин; в) лейцилаланиллизин; г) Трп-Вал-Гли-Лиз; д) AAGS.

5. Сколько трипептидов может быть образовано аминокислотами глицином и аланином? Запишите их.

6. Аминокислоту лизин в промышленности получают микробиологическим методом. Какую массу лизина можно выделить из культуральной жидкости объемом 3 м³ и плотностью 1,05 г/см³, где массовая доля лизина составляет 12 %, а производственные потери – 15 %? Ответ: 321,3 кг.

7. Интерфероны подавляют развитие вирусов в организме. Их можно выделить из лейкоцитов человека, однако выход интерферона составляет всего 1 мкг из 1 дм³ крови. Для получения значительных количеств интерферона его гены были клонированы в бактериальных клетках. Клонированные гены экспрессировались с образованием функционально активных белков – интерферонов.

а)   Проведенный анализ показал, что в 1 см³ культуры содержится 10⁹ бактериальных клеток, а в каждой клетке находится 0,1 пг белка, 5 % которого составляет интерферон. Подсчитайте, сколько интерферона можно получить из 100 дм³ культуры.

б)   Рассчитайте, сколько молекул интерферона вырабатывает 1 бактериальная клетка, если молярная масса интерферона составляет 30 000 г/моль.

в)    Во сколько раз содержание интерферона в культуре клеток выше, чем в крови?

Ответ: 0,5 г; 10⁵ молекул; в 5000 раз.

8. В составе молекулы рибонуклеазы содержится 10 остатков лизина, мольная доля которого в  молекуле  равна  8,06 %. Оцените  относительную молекулярную массу фермента. Ответ: 13650.

9. Массовая доля  железа  в  составе  гемоглобина равна 0,347 %. Рассчитайте относительную молекулярную массу гемоглобина, если известно, что он состоит из 4 протомеров, и в составе каждого протомера содержится по одному атому железа. Ответ: 64500.

10. В результате гидролиза гексапептида получен набор следующих дипептидов: ала-гис, про-лиз, гис-тре, тре-сер, сер-про. Определите первичную структуру пептида.